松材線蟲自然侵染后松樹感病進(jìn)程中光合作用及抗氧化酶活性的變化

張 慧，黃秀鳳，徐華潮

(1.臨安市林業(yè)局，浙江臨安 311300;2.富陽市林業(yè)局，浙江富陽 311400;3.浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江臨安 311300)

松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus 是國際上公認(rèn)的重要檢疫性有害生物。它能引起松材線蟲病(Pine Wilt Disease 或稱Pine Wood Nematode)(柴希民等，2003;楊寶君，2003)，使感病植株迅速枯死，且傳播蔓延極快，一旦感病將造成極為嚴(yán)重的損失，不論是幼齡小樹，還是幾十年生的參天大樹都可被害致死，松樹感病后一般1-3個(gè)月內(nèi)即可全株枯死(秦復(fù)牛等，2003)。該病最早于1905年在日本九州島的長崎發(fā)生。我國于1982年在南京中山陵的黑松Pinus thunbergii 上發(fā)現(xiàn)松材線蟲，現(xiàn)已迅速蔓延。

盡管松材線蟲病的發(fā)現(xiàn)已有近百年的歷史(Yano，1913)，但松材線蟲的致病性卻在1971年最先由清原和德重在接種試驗(yàn)中才得到證實(shí)(清原友也，1971)，后續(xù)的研究進(jìn)一步明確了松材線蟲是引起松樹死亡的病原。人們只是在近四十年內(nèi)，才對(duì)松材線蟲病進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，主要涉及不同寄主松樹品種的抗病性、病原線蟲的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)、線蟲的傳播媒介、病害的發(fā)生和擴(kuò)散規(guī)律以及防治和控制等(張星耀等，2003;李蘭英等，2006;胡霞等，2007;劉洪劍等，2007;謝立群等，2007)。由于松材線蟲病是以病原線蟲為主導(dǎo)，綜合有人為參與、媒介天牛傳播、寄主松樹以及環(huán)境因素互作的一種復(fù)雜病害系統(tǒng)，因此隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)該病與通常認(rèn)識(shí)的松材線蟲有許多不同，尤其是其致病機(jī)理尚不明確，致使對(duì)該病的防治和控制工作進(jìn)展緩慢(朱克恭，1992;趙博光等，2000)。

綠色植物光合作用是森林生態(tài)系統(tǒng)能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán)的基礎(chǔ)，也是生物固碳的最主要方式，因此，以光合作用為基礎(chǔ)，研究植被生產(chǎn)力形成過程及其對(duì)未來氣候變化的響應(yīng)，一直是植物生理學(xué)及陸地碳循環(huán)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。目前，國內(nèi)外對(duì)植物光合作用的研究大多集中在農(nóng)作物、草木或樹苗等易觀測(cè)對(duì)象上(于強(qiáng)等，1999)，而對(duì)高大喬木的研究則相對(duì)較少，尤其是在受病蟲害危害后對(duì)植物光合生理的影響方面，鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。

部分學(xué)者探討了感染松材線蟲病后，松樹光合作用與致病性的相互關(guān)系。Melakeberhan 等用松材線蟲接種歐洲赤松幼苗，發(fā)現(xiàn)接種后24-36 h葉綠素?zé)晒饧搬樔~水勢(shì)會(huì)降低;研究后指出，對(duì)光合作用的影響可能亦是導(dǎo)致松樹死亡的重要因素(Melakebaran et al.，1990，1991)。但另有研究表明，在病害發(fā)展早期，當(dāng)葉部水勢(shì)高時(shí)松苗光合特性不受影響，到后期松苗光合作用降低是由于葉部水分虧缺引起的(Fukuda et al.，1992)。但對(duì)野外自然條件下感染松材線蟲病后松樹進(jìn)行光合生理研究的報(bào)道尚未見到。本實(shí)驗(yàn)以黑松、馬尾松為研究對(duì)象，研究探討了松材線蟲在自然侵染植株后，對(duì)寄主光合作用和針葉部分生理生化指標(biāo)的影響，為進(jìn)一步研究松材線蟲的致病機(jī)理和早期診斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)樣地分別選在浙江省平湖市平湖林場和余姚市牟山鎮(zhèn)，兩地均屬亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候區(qū)，四季分明、氣候溫和、日照充足、雨量充沛。分別選取自然感病狀態(tài)下的黑松和馬尾松。根據(jù)樹勢(shì)生長狀況、松針顏色及松脂流量變化，結(jié)合線蟲分離，將不同受害程度的松樹分為三個(gè)階段，同時(shí)選擇健康的一類(無線蟲分離到)作為對(duì)照，具體標(biāo)準(zhǔn)如下:

健康期(HW):外觀健康，松脂分泌正常，未能分離到松材線蟲;

感病初期(IP):外觀健康，松脂分泌明顯減少，天牛取食點(diǎn)附近有少量松針褪色、萎蔫;

感病中期(MP):頂梢及其它嫩枝僅基部偶見黃色針葉，其余枝條上出現(xiàn)部分黃色針葉，其它針葉失去光澤;

感病重期(TP):頂梢及1 a 生嫩枝成灰綠色、萎蔫，部分針葉黃綠色，多年生枝條大多無綠色針葉。

1.2 采樣方法

選取處于不同感病階段的平湖黑松、余姚馬尾松各3 棵，采用離體測(cè)定，每株分上中下東西南北共測(cè)定12 次，枝條采樣后立即水培同時(shí)進(jìn)行光合作用的測(cè)定;測(cè)定葉綠素含量和含水量指標(biāo)的樣品選取兩種松樹針葉部分，于低溫保鮮箱中保存至室內(nèi)測(cè)定;測(cè)量抗氧化酶活性的針葉樣品則于液氮罐中冷凍保存至室內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。

1.3 氣體交換和葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定

采用美國LI-COR 公司生產(chǎn)的便攜式光合系統(tǒng)(LiCor-6400，USA)測(cè)定光響應(yīng)曲線和熒光葉室(6400-09)測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)，重復(fù)12 次;光響應(yīng)曲線測(cè)定按Kitao 等(2003)的方法進(jìn)行，光量子通量密度(PARI)設(shè)置為0，100，200，400，600，900，1500 (單位μmol/m2/s)。其他的葉綠素?zé)晒鈪?shù)按Genty 等(1989)的公式計(jì)算。因針葉狹小，無法填滿葉室，故采用一束針葉平鋪葉室，將整個(gè)葉室表面填滿，每束平均18 根針葉。

1.4 生化分析

采用直接浸提法(李得孝等，2005)測(cè)定針葉色素含量;烘干法(鄭炳松，2006)測(cè)定針葉含水量(鮮重的);滴定法(鄭炳松，2006)測(cè)定過氧化氫酶活性;分光光度法(鄭炳松，2006)測(cè)定超氧化物歧化酶活性;愈創(chuàng)木酚法(王學(xué)，2006)測(cè)定過氧化物酶活性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Sigmaplot 軟件作不同感病階段凈光合作用速率圖和葉綠素?zé)晒鈪?shù)響應(yīng)曲線;利用Photosyn Asisstant 軟件計(jì)算光補(bǔ)償點(diǎn)和光飽和點(diǎn);用SPSS軟件作差異分析。

2 結(jié)果與分析

結(jié)果顯示，兩種松樹各個(gè)感病階段凈光合速率差異性顯著。由圖1 可看出，自然感病黑松和馬尾松各感病階段凈光合作用速率(Pn)大小依次為，感病初期＞健康階段＞感病中期＞感病重期，即在感病初期Pn 最高，其中馬尾松的Pn 上升更加明顯，但到感病中期后Pn 迅速下降，馬尾松光合速率數(shù)值在感病中期已為負(fù)值。黑松的氣孔導(dǎo)度(Gs)隨著感病程度的遞增，出現(xiàn)明顯的下降，馬尾松的Gs 在感病初期略有上升，隨后迅速下降。但二者的胞間CO2濃度(Ci)數(shù)值未出現(xiàn)明顯下降，反而略有上升趨勢(shì)。黑松、馬尾松的蒸騰速率(Tr)隨著病程的加重出現(xiàn)下降趨勢(shì)，其變化趨勢(shì)同Gs 非常相似。

圖1 黑松和馬尾松各個(gè)感病階段凈光合作用速率變化(光強(qiáng)600μmol/m2/s)Fig.1 Lodgepole pine and Masson Pine all changes in the sense of disease stage of net photosynthesis rate(Light intensity 600μmol/m2/s)

由圖2 可以看出，黑松和馬尾松的ФPSⅡ在感病初期并沒有下降，馬尾松的ФPSⅡ反而略有上升，但隨著感病程度的增加，兩者的ФPSⅡ均迅速下降，在任何光強(qiáng)下，兩者的ФPSⅡ均顯著低于感病初期和健康木。Fv'/Fm'和qP 隨著感病進(jìn)程的增加，數(shù)值也不斷下降，變化規(guī)律與ФPSⅡ基本相似。不同感病階段的NPQ 數(shù)值也出現(xiàn)變化，黑松的NPQ 在感病初期明顯上升，而感病中期只在低光強(qiáng)下高于健康木，在高光強(qiáng)下與健康木基本一致，在感病重期NPQ 則迅速下降。馬尾松的NPQ 在感病初期與健康木基本一致，在感病中后期迅速下降。

圖2 黑松和馬尾松葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化Fig.2 Changes of chlorophyll fluorescence parameters of lodgepole pine and Masson Pine

從表3 可見黑松和馬尾松感病初期，針葉葉綠素a、b 和類胡蘿卜素含量會(huì)先上升，隨后會(huì)持續(xù)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。從圖3 可以看出松材線蟲侵染后，馬尾松感病初期針葉含水量較健康階段略有上升，隨后逐漸下降，而黑松的針葉含水量則隨感病程度持續(xù)下降，且下降速度略快于馬尾松。黑松和馬尾松受松材線蟲感染后，導(dǎo)致了兩種松樹的抗氧化酶系統(tǒng)活性發(fā)生變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黑松和馬尾松針葉CAT 活性出現(xiàn)持續(xù)下降，但馬尾松下降速度更加迅速。兩種松樹的POD 活性則在感病初期略有升高，隨后持續(xù)下降，兩種松樹的SOD 活性在感病初期也略有升高，但隨后基本保持不變。

表3 松材線蟲侵染馬尾松、黑松后其針葉葉綠素和類胡蘿卜素含量變化Table 3 Pine wood nematode infection of Pinus massoniana pine needles，the chlorophyll and carotenoid content change

4 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，松材線蟲侵染黑松和馬尾松后，在感病初期，馬尾松的Pn 先出現(xiàn)上升現(xiàn)象，與健康階段的差異性較大，為什么引起這一現(xiàn)象有待于進(jìn)一步研究。由分析結(jié)果可看出，兩種試驗(yàn)樹隨著病程的加重，兩者的Pn 均明顯下降。只是在感病中期馬尾松的Pn 已出現(xiàn)負(fù)值，下降明顯，說明馬尾松對(duì)線蟲病可能比黑松更敏感，而楊寶君等人(1987，1993)則表明馬尾松抗性更強(qiáng)，這與本試驗(yàn)結(jié)果不一致，可能與試驗(yàn)地環(huán)境因子有關(guān)，具體原因還有待進(jìn)一步研究。葉片含水量是引起Pn 下降的重要因素，有研究表明松材線蟲侵入植株后會(huì)逐漸導(dǎo)致松樹體內(nèi)水分輸導(dǎo)被中斷造成的，進(jìn)而導(dǎo)致水分虧缺 (談家金等，2001)，本研究中松樹表現(xiàn)出萎蔫的癥狀，針葉含水量也下降，這與 Melakeberhan 和 Fukuda(Melakebaran et al.，1990;1991;Fukuda et al.，1992)研究結(jié)果相似，進(jìn)一步證明了松樹感染松材線蟲后水分傳導(dǎo)受阻的結(jié)論。由于含水量的下降引起了針葉Pn、蒸騰作用和Gs的下降，但胞間CO2濃度數(shù)值未下降，因此光合作用速率的下降與氣孔因素?zé)o關(guān)。

PhiPS2 數(shù)值隨著松材線蟲的脅迫加深逐漸下降，表明電子傳遞速率下降，而ФPSⅡ則受Fv'/Fm'和qP 兩者的影響。感病初期和健康階段Fv'/Fm'無明顯差異，隨著線蟲的大量繁殖出現(xiàn)持續(xù)下降，而qP 在感病中期下降明顯，但隨后基本不變，表明在感病中期電子傳遞的下降主要是Fv'/Fm'和qP 兩者下降的結(jié)果，而在重期則是Fv'/Fm'下降的原因。葉綠素含量和類胡蘿卜素含量隨著病程的加重，也呈下降趨勢(shì)，間接導(dǎo)致Pn 下降，但兩者在感病初期均有所升高，這可能是植物的防御反應(yīng)(鄒春靜等，2009)。

電子傳遞速率下降明顯，還會(huì)引起多余電子，植物在吸收的光能超過所利用的能量時(shí)，會(huì)啟動(dòng)非輻射能量的耗散途徑來耗散過剩的激發(fā)能以保護(hù)光合機(jī)構(gòu)免受傷害，通過抗氧化酶系統(tǒng)清理過氧化氫酶能夠?qū)2O2分解為H2O 和O2。過氧化物酶是植物體內(nèi)清除H2O2的重要保護(hù)酶，廣泛存在于植物的各個(gè)組織器官中，與植物抗性代謝關(guān)系很大。超氧化物歧化酶的活性與植物抗性密切相關(guān)，它能夠防御活性氧或其他過氧化物自由基對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害，普遍存在于植物的所有組織中。隨著松材線蟲侵染時(shí)間的延長，CAT 活性下降表明，受松材線蟲感染松樹體內(nèi)清除氧自由基的能力下降，細(xì)胞膜損傷加重 (陳玉惠等，2002)。而受松材線蟲感染后，POD 活性和SOD的活性升高則說明松樹自身通過水水循環(huán)的作用發(fā)起了一定的防御措施，但這種抗逆性隨著線蟲的大量繁殖而減弱至消失。同時(shí)，隨著非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ)數(shù)值的降低，寄主吸收的多余光能不能被耗散，形成自由基，進(jìn)一步破壞抗氧化酶系統(tǒng)，引起Pn 下降。

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