紅景天對(duì)肺癌多藥耐藥細(xì)胞A549／DDP的促凋亡作用研究

黎 萍，趙麗晶，張 捷，李君瑤，茍偉會(huì)，王 晶

（1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 兒科，吉林 長春130041；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，吉林 長春130021；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，吉林 長春130041）

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤，也位居我國城市惡性腫瘤發(fā)病率及死亡率的首位，嚴(yán)重威脅人類 健 康[1]。非小細(xì)胞肺癌（non－small cell lung cancer，NSCLC）為肺癌的主要類型，占肺癌的75%－80%；由于目前肺癌的臨床診斷水平尚比較有限，70%以上的NSCLC患者確診時(shí)已為晚期，5年生存率低于10%。因此，化療在NSCLC的治療中具有重要作用；而NSCLC的化療耐藥極大的影響了肺癌的治療效果[2]。近年來，尋找逆轉(zhuǎn)化療耐藥的藥物以及新的有效化療藥物已經(jīng)成為肺癌研究的熱點(diǎn)之一。

研究表明，多種天然植物中含有對(duì)人毒副作用小、并且十分有效的抗腫瘤成分；因而，國內(nèi)外開發(fā)抗腫瘤藥物的新方向之一即為植物類抗癌藥物的研發(fā)。紅景天（rhodiola sacra）有效成分是從紅景天根中提取的，目前已分離出40多種，其主要有效成分為紅景天甙。研究表明，紅景天具有抗缺氧、抗氧化、抗寒冷、抗疲勞及抗腫瘤等作用[3]。近年來，關(guān)于紅景天的抗腫瘤作用及其機(jī)制，國內(nèi)外均可見報(bào)道，證實(shí)了紅景天具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[4，5]。但是紅景天對(duì)肺癌多藥耐藥細(xì)胞是否有促凋亡作用，目前尚未見報(bào)道。為此，我們通過MTT法、流式細(xì)胞儀以及western blot法等實(shí)驗(yàn)方法來研究紅景天對(duì)人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞A549／DDP的生長抑制、促凋亡作用，為進(jìn)一步闡明紅景天的抗腫瘤機(jī)制，用于腫瘤的臨床治療，尤其是在肺癌化療耐藥的臨床應(yīng)用，提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料

人肺腺癌細(xì)胞多藥耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549／DDP購自第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院呼吸病研究所。A549／DDP用RPMI－1640培養(yǎng)基（含10%新生牛血清），在37℃、5%CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)，胰酶消化、傳代。紅景天粉為北京同仁堂公司生產(chǎn)；MTT、順鉑購自美國Sigma公司；胰酶、RPMI－1640培養(yǎng)基為美國Hyclone公司產(chǎn)品；Annexin V－FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒購自上海碧云天公司。cleaved caspase－3、cleaved PARP 一 抗 購 自 Cell Signal Techology公司，二抗購自武漢博士德公司。

1.2 MTT法檢測細(xì)胞生存率

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，0.25%胰酶消化后，96孔板中每孔加入100μl細(xì)胞懸浮液，每孔含2×104個(gè)細(xì)胞。各組細(xì)胞加入0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、0mg／ml濃度梯度的紅景天，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，至孵箱孵育24h后，各孔加入新鮮配制 MTT20μl（濃度為5g／L），溫箱孵育4h，吸去上清，每孔加入100μl DMSO，震蕩10min，用酶標(biāo)儀檢測各孔的吸光度值（OD570），計(jì)算細(xì)胞的生長抑制率：細(xì)胞生長抑制率（%）＝（1－實(shí)驗(yàn)組／對(duì)照組）×100%。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡率

為了確定紅景天是否具有誘導(dǎo)肺癌耐藥細(xì)胞凋亡的作用，我們用1.8mg／ml紅景天作用于A549／DDP細(xì)胞12、24、48h，分別收集細(xì)胞1×106個(gè)，加入500μl的緩沖液懸浮細(xì)胞；進(jìn)行Annexin－V和Pl雙染，混勻；于室溫避光反應(yīng)15min；在1h內(nèi)入流式細(xì)胞儀檢測、分析凋亡細(xì)胞比例。

1.4 凋亡相關(guān)蛋白的檢測

采用1.8mg／ml紅景天作用于A549／DDP細(xì)胞12、24、48h，收集細(xì)胞，提取各組細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后，取30μg蛋白進(jìn)行SDS－PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，加入抗cleaved－caspase 3以及cleaved－PARP抗體雜交，再加入HRP－偶聯(lián)二抗，按ECL試劑盒說明書發(fā)光、曝光。以β－actin為內(nèi)參照，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)光密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究中所有計(jì)量數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。3組以上資料間比較，采用多樣本方差分析，組間兩兩比較采用LSD法；采用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)、分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅景天抑制肺癌細(xì)胞增殖

用MTT法觀察到A549／DDP細(xì)胞在紅景天的作用下存活率均顯著下降，并呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性。計(jì)算出紅景天對(duì)A549／DDP的24h IC50為 （1.91±0.32）mg／ml。

圖1 不同濃度紅景天對(duì)A549／DDP細(xì)胞生存率的影響

2.2 紅景天作用下肺癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變

倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果：1.8mg／ml的紅景天作用培養(yǎng)的A549／DDP細(xì)胞12h后，細(xì)胞團(tuán)塊變得松散，細(xì)胞皺縮呈圓形或卵圓形，折光性差，與鄰近的細(xì)胞脫離，隨著濃度的增高，越來越多的細(xì)胞脫離基質(zhì)。隨著濃度的增高，A549／DDP細(xì)胞細(xì)胞聚集成團(tuán)的現(xiàn)象受到抑制，濃度越高，現(xiàn)象越明顯，細(xì)胞相繼皺縮，且折光性差越來越差。形態(tài)學(xué)結(jié)果提示，紅景天可引起肺癌多藥耐藥細(xì)胞脫落凋亡或死亡，并呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性。

2.3 紅景天誘導(dǎo)A549／DDP細(xì)胞凋亡率的檢測

為了確定紅景天是否具有誘導(dǎo)肺癌耐藥細(xì)胞凋亡的作用，我們用1.8mg／ml紅景天作用于A549／DDP細(xì)胞12、24、48h，用 Annexin－V和Pl進(jìn)行染色后，用流式細(xì)胞儀分析凋亡細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紅景天作用細(xì)胞后，早期凋亡的細(xì)胞和晚期凋亡的細(xì)胞均明顯多于對(duì)照組，見表1；各組細(xì)胞蛋白電泳結(jié)果顯示，凋亡相關(guān)蛋白cleaved－caspase 3以及cleaved PARP表達(dá)明顯增加，且這種作用呈時(shí)間依賴，見圖2。結(jié)果表明，藥物作用組凋亡細(xì)胞所占的比例多于非藥物作用組。上述結(jié)果提示，紅景天時(shí)間依賴誘導(dǎo)A549／DDP肺癌多藥耐藥細(xì)胞發(fā)生凋亡。

表1 紅景天作用下，A549／DDP細(xì)胞的凋亡率（±s；n＝3）單位：%

表1 紅景天作用下，A549／DDP細(xì)胞的凋亡率（±s；n＝3）單位：%

注：＊與△比，P＜0.01；＊之間比較：P＜0.01.

作用時(shí)間 早期凋亡率 晚期凋亡率 總凋亡率空白對(duì)照組 0.51±0.12△ 2.19±0.43△ 2.7±0.54△12小時(shí) 2.32±0.37＊ 9.31±1.52＊ 11.63±2.12＊24小時(shí) 3.67±0.65＊ 18.56±3.27＊ 22.23±4.23＊48小時(shí) 6.22±1.02＊ 27.42±4.78＊ 33.64±5.12＊F 33.26 23.97 45.54 P＜0.000 ＜0.000 ＜0.000

圖2 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白電泳圖

3 討論

紅景天系薔薇目景天科紅景天屬，多年生草本或亞灌木野生植物，花、根、莖之浸液均呈紅色而得名；藥理學(xué)研究表明其主要藥理活性成分為紅景天苷（Salidroside）[3]。紅景天對(duì)腫瘤的抑制作用國內(nèi)外均有報(bào)道[4，5]。紅景天在體外對(duì)人肝癌 HepG2細(xì)胞具有顯著的抑制增殖和促進(jìn)凋亡作用[6]；在體內(nèi)可抑制肝癌荷瘤小鼠的腫瘤生長，延長其生存時(shí)間；具有明顯的抗腫瘤作用，其機(jī)制可能與提高機(jī)體免疫功能有關(guān)[4]。紅景天在體內(nèi)、體外對(duì)乳腺癌、宮頸癌均有生長抑制作用[7]。本研究顯示紅景天可明顯抑制人肺腺癌耐藥細(xì)胞A549／DDP的生長，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

肺癌是我國的腫瘤發(fā)病譜中的主要病種，對(duì)于其最常見的類型NSCLC，化療藥物的臨床療效已達(dá)到平臺(tái)期，5年生存率仍較低。腫瘤細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療預(yù)后關(guān)系密切，耐藥細(xì)胞對(duì)藥物誘導(dǎo)的凋亡有耐受[8]。Caspase3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性蛋白酶，也是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，caspase3激活后，可自身裂解為cleaved caspase3并直接導(dǎo)致凋亡細(xì)胞解體，酶解細(xì)胞機(jī)構(gòu)蛋白，其中最主要的蛋白為聚（ADP－核糖）（PARP）裂解為cleaved－PARP，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。因而，casapase3以及PARP的裂解水平，即cleaved－caspase 3以及cleaved PARP的表達(dá)水平能反映凋亡的發(fā)生水平。已有報(bào)道表明，紅景天可能通過干擾細(xì)胞代謝、改變細(xì)胞外衣的性質(zhì)抑制肺腺癌細(xì)胞體外生長[9]。本研究中，紅景天能抑制肺腺癌耐藥細(xì)胞的生長，紅景天對(duì)A549／DDP的抑制作用呈時(shí)間依賴性、濃度依賴性。通過計(jì)算，紅景天對(duì) A549／DDP抑制的24hIC50為（1.91±0.32）mg／ml；取略低于IC50的濃度1.8 mg／ml紅景天作用于A549／DDP細(xì)胞，通過檢測細(xì)胞凋亡率、凋亡相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)，該濃度紅景天可以誘導(dǎo)A549／DDP細(xì)胞的凋亡發(fā)生，且作用呈時(shí)間依賴性，48小時(shí)凋亡率可達(dá)（33.64±5.12）%；凋亡相關(guān)蛋白cleaved－caspase3及cleaved PARP的表達(dá)水平增加。有研究表明，紅景天可能通過下調(diào)腫瘤組織中 CD4＋CD25＋Treg 比 例、Foxp3 和 TGF－βmRNA的表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答，抑制Lewis肺癌小鼠移植瘤的生長[10]。

綜上，本研究表明，紅景天對(duì)多藥耐藥肺癌細(xì)胞抑制增殖、促進(jìn)凋亡的作用；此外，有研究表明紅景天能增強(qiáng)肺癌抗腫瘤免疫應(yīng)答[10]，提示紅景天可能在化療耐藥的肺癌治療中有一定的應(yīng)用前景。

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)肺癌學(xué)組中國肺癌防治聯(lián)盟，原發(fā)性支氣管肺癌早期診斷中國專家共識(shí)（草案）[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2014，37（3）：172.

[2]于 慧，王佳蕾，晚期非小細(xì)胞肺癌的內(nèi)科治療[J].2013，23（2）：155.

[3]顧正位.紅景天藥理作用及制劑研究進(jìn)展[J].2013，37（5）：451.

[4]何小喜，莫書榮.紅景天苷對(duì)腹水型H22肝癌抑制作用及其機(jī)制的初步研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2014，30（05）：688.

[5]Skopinska－Rozewska E，Malinowski M，Wasiutynski A，et al.The influence of Rhodiola quadrifida 50%hydro－alcoholic extract and salidroside on tumor－induced angiogenesis in mice[J].Pol J Vet Sci，2008，11（2）：97.

[6]龐曉斌，謝欣梅，趙清輝.紅景天苷對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖及凋亡的影響[J].中國藥學(xué)雜志，2014，49（3）：195.

[7]范維琥，戚瑋琳，李 勇，等.紅景天對(duì)裸鼠乳腺癌移植瘤的影響[J].中國癌癥雜志，2006，16（09）：710.

[8]Johnstone R.W.，A.A.RuefliS.W.Lowe，Apoptosis：A link between cancer genetics and chemotherapy[J].Cell，2002，108（2）：153.

[9]盛 輝，苑春莉，李 洋.紅景天對(duì)體外培養(yǎng)肺腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2005，9（6）：936.

[10]孫芳云，張 敏，趙亞玲.紅景天提取物對(duì)Lewis肺癌小鼠移植瘤中CD4＋CD25＋Treg的抑制作用[J].中國腫瘤生物治療雜志，2013，20（4）：444.