中藥成分對新城疫強(qiáng)毒感染DF1能力的影響

劉 坤，鄒海濤，李燕榮，李云崗，劉家國，姜 平，蘭鄒然

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，山東 濟(jì)南 250022）

雞新城疫是由新城疫病毒（NDV）引起的一種急性高度接觸性傳染病，發(fā)病率和病死率高，對養(yǎng)禽業(yè)危害大。到目前為止治療病毒病還缺乏特效方法。接種疫苗是最普遍的預(yù)防措施，但是很難全面控制這類疫病。近年來，研究證實(shí)許多中草藥以及其主要成分都具有抗病毒活性[1]，本試驗(yàn)測定了黃芩苷和氧化苦參堿等10種中藥成分對新城疫強(qiáng)毒感染雞胚成纖維細(xì)胞（DFI）能力的影響，為篩選出具有較強(qiáng)抗病毒作用的中藥成分復(fù)方提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物和病毒 黃芩苷、三七總皂苷、氧化苦參堿、黃連小檗堿、菊花總黃酮、綠原酸、黃芪多糖、板藍(lán)根多糖、板藍(lán)根生物堿和淫羊藿多糖中藥提取物，購自西安普萊特生物工程公司；NDV F48E8株，山東省家禽研究所惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑和儀器 DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液；胎牛血清；MTT粉末；胰蛋白酶-EDTA；CO2培養(yǎng)箱；倒置顯微鏡；酶標(biāo)儀；電子天平。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 將各中藥成分用2%細(xì)胞維持液配制成含量為5 mg/mL的液體，過濾除菌，倍比稀釋進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)測定藥物的最大安全質(zhì)量濃度[2]（氧化苦參堿、板藍(lán)根生物堿、板藍(lán)根多糖，2 500 μg/mL；金銀花提取物、三七總皂苷，80 μg/mL；黃芪多糖，600 μg/mL；黃芩苷，150 μg/mL；黃連小檗堿，1 250 μg/mL；菊花總黃酮、淫羊藿多糖，300 μg/mL）。臨用前將其作為最大濃度1，然后進(jìn)行倍比稀釋成2、3、4、5種濃度。

1.3.2 將病毒接種于單層雞胚成纖維細(xì)胞（DF1），37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)，48 h收取細(xì)胞毒，按Reed-Muench法[3]測定TCID50，用細(xì)胞維持液配成100 TCID50濃度備用。

1.3.3.1 將已經(jīng)長成致密單層的DF1用胰酶消化，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至5×105個(gè)/mL后加入到96孔細(xì)胞板中，每孔100 μL，37 ℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長成單層后進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)組分別以3種方式[5]加入各質(zhì)量濃度的中藥成分和NDV，每種濃度的中藥成分設(shè)4孔重復(fù)，同時(shí)設(shè)病毒與細(xì)胞對照組。（1）先加中藥成分后接種NDV：每孔加入100 μL不同質(zhì)量濃度的中藥成分，培養(yǎng)2 h后棄掉孔內(nèi)液體，再加入100 μL NDV；（2）先接種NDV后加中藥成分：方法同上，順序相反；（3）NDV和中藥成分感作后同時(shí)加：4℃感作2 h后加入到DF1中，每孔100 μL。

1.3.4 細(xì)胞活性測定 37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h后，每孔加入30 μL MTT溶液，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，倒掉孔內(nèi)液體，加入100 μL DMSO，用微量振蕩器震蕩10 min后，用酶標(biāo)儀測定OD570值作為衡量指標(biāo)。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析與處理 用SPSS軟件對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 先加中藥后加病毒 從表1可以看出，黃芩苷在9.375～150 μg/mL，黃芪多糖在37.5～300 μg/mL，菊花總黃酮和淫羊藿多糖在18.75～300 μg/mL，氧化苦參堿在156.25～1250 μg/mL，三七總皂苷在5～40 μg/mL，板藍(lán)根多糖和板藍(lán)根生物堿在156.25～1250 μg/mL濃度范圍內(nèi)，均能抑制病毒感染細(xì)胞，而綠原酸和黃連小檗堿效果不明顯。

表1 先加中藥時(shí)10種中藥成分的OD570值

2.2 先加病毒后加中藥 從表2可以看出，黃芩苷在9.375～150 μg/mL，黃芪多糖在37.5～300 μg/mL，菊花總黃酮在18.75～300 μg/mL，氧化苦參堿在156.25～1 250 μg/mL，板藍(lán)根多糖和板藍(lán)根生物堿均在156.25～1 250 μg/mL，三七總皂苷在5～20 μg/mL，淫羊藿多糖在18.75 μg/mL，有抑制病毒的作用。而綠原酸和黃連小檗堿則無抗病毒效果。

2.3 中藥和病毒感作后同時(shí)加入 從表3可以看出，黃芩苷在9.375～150 μg/mL，菊花總黃酮在18.75～300 μg/mL，氧化苦參堿在156.25～2 500 μg/mL，三七總皂苷在5～40 μg/mL，黃芪多糖在37.5～300 μg/mL，板藍(lán)根多糖和板藍(lán)根生物堿在156.25～1 250 μg/mL，黃連小檗堿在156.25～312.5 μg/mL，淫羊藿多糖在37.5 μg/mL能夠抑制病毒感染細(xì)胞，而綠原酸無效果。

3 討論

近年來，很多研究已經(jīng)證實(shí)，許多中草藥以及其成分具有抗病毒活性，并用于抗病毒和細(xì)菌感染[5]。本試驗(yàn)通過三種不同方式將NDV和中藥成分加入到DF1中，充分作用后用MTT法測定細(xì)胞的OD570值作為中藥對病毒抑制作用的衡量指標(biāo)。當(dāng)試驗(yàn)組的OD值顯著高于病毒對照組時(shí)，表明藥物在適當(dāng)?shù)臐舛确秶鷥?nèi)能夠抑制病毒的感染。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，黃芩苷、三七總皂苷、黃芪多糖、板藍(lán)根多糖、板藍(lán)根生物堿、氧化苦參堿、菊花總黃酮這7種藥物無論哪種加藥方式，均能夠?qū)Σ《井a(chǎn)生抑制作用，淫羊藿多糖在先于病毒加入時(shí)效果明顯，綠原酸在與病毒感作后有較弱的抗病毒效果，而黃連小檗堿對NDV不產(chǎn)生抑制效果。此次試驗(yàn)的結(jié)果與邢玉娟[6]等人研究相似。但試驗(yàn)中中藥的最大安全濃度以及OD值與先前報(bào)道的數(shù)值[3]有些不同，或許與中藥成分的質(zhì)量以及細(xì)胞不同有關(guān)。

從給藥方式來看，總體上，先加中藥后加病毒對抑制病毒感染的能力較其他兩種方式要強(qiáng)。不同藥物濃度對抑制病毒的能力也有一定影響，如黃芩苷和菊花總黃酮在高濃度時(shí)對病毒的抑制效果要強(qiáng)于低濃度時(shí)，而三七總皂苷和氧化苦參堿這兩種中藥成分則在較低濃度時(shí)對病毒的抑制作用較強(qiáng)。因此，在選取中藥要同時(shí)考慮以上兩因素，才能發(fā)揮中藥的最佳抗病毒效果。

表2 先加病毒時(shí)10種中藥成分的OD570值

表3 中藥病毒感作后10種中藥成分的OD570值

在治療病毒病方面，一些細(xì)胞因子雖然能夠抑制病毒復(fù)制，但是由于成本高，所以仍然停留在實(shí)驗(yàn)室研究或者臨床試驗(yàn)階段。此外，雖然還有一些化學(xué)合成的抗病毒藥物在臨床上使用，但其臨床效果也不盡人意，并存在藥物殘留等不利因素。鑒于目前我國對病毒病防治存在一定困難，中藥在治療病毒病方面的應(yīng)用具有不錯(cuò)的前景。通過此次試驗(yàn)，篩選出抗病毒效果較好的單藥成分，為組成中藥組方，發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，使中藥達(dá)到抑制病毒的最佳效果奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

[1]Ji Y B.Chemistry and Pharmacology of Chinese Herbal Medicine Compound People’s Health Press[J].Beijing，2003，Suppl.pp.18-35.

[2]劉家國，陳玉庫，胡元亮，等.幾種天然藥物成分在體外CEF中最大安全濃度的測定[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2002，23（3）：88-91.

[3]殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].2版.北京：科學(xué)出版社，1997：204-246.

[4]李德勝，胡元亮，索珍，等.12種藏藥對新城疫病毒感染雞胚成纖維細(xì)胞能力的影響[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，28（9）：1061-1064.

[5]Schnitzler P，Schuhmacher A，Reichling J.Virucidal effect of peppermint oil on the enveloped viruses herpes simplex virus type 1 and type 2 in vitro[J].Phytomedicine，2003，504-510.

[6]邢玉娟，陳玉庫，胡元亮，等.7種中藥成分對新城疫病毒感染雞胚成纖維細(xì)胞能力的影響[J].中國獸醫(yī)雜志，2011，47（9）:46-48.