副雞禽桿菌莢膜多糖的提取及HPLC分析

王雪敏，路迎迎，陳小玲，路明華，張培君，龔玉梅，王宏俊

（1.北京市農林科學院畜牧獸醫(yī)研究所 畜禽疫病防控技術北京市重點實驗室，北京 海淀 100097；2.河北工程大學農學院，河北 邯鄲 056021；3.河北省禽病工程技術研究中心，河北 邯鄲 056021）

雞傳染性鼻炎是由副雞禽桿菌（Avibacterium paragallinarum，Apg)引起的一種急性呼吸道傳染性疾病。主要引起育成雞的生長受阻，增重減慢，雞群的死亡數(shù)和淘汰數(shù)增加，產蛋率下降給養(yǎng)殖戶帶來了巨大的損失[1]。1920年，由Beach首先報道，該病，1931年DeBlieck初次分離到該病原體，該病目前在世界許多國家和地區(qū)都有發(fā)生和流行[2]。

莢膜多糖（capusular polysaccharide，CPS）是大分子物質，分離制備比單糖和小分子寡糖更加復雜，高度含水量（＞95%）[3]，它們是由重復單糖通過糖苷鍵連接而成同聚體或異聚體，CPS的結構復雜決定于糖鏈的大小、分枝數(shù)目、單糖的組成等。國外有很多關于不同細菌菌株的多糖結構的報道，分子量在萬以上，多為葡萄糖，半乳糖等組成的雜多糖[4]。已有報道多糖是副雞禽桿菌的有效抗原成分，經試驗證，實接種有莢膜副雞禽菌株的動物表現(xiàn)出典型的臨床癥狀，而接種過沒有莢膜副雞禽菌株的動物，卻沒有出現(xiàn)臨床癥狀，這一結果說明莢膜是副雞禽菌的一種重要的毒力因子[5]。CPS單獨活性的研究及開發(fā)尚未見報道，鑒于多糖對機體的免疫調節(jié)活性具有廣泛影響，本研究將為相關機理的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種 Apg B型分離株，由北京市農林科學院畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病防控技術北京市重點實驗室分離鑒定并保存。

1.2 主要試劑及儀器 胰蛋白大豆瓊脂（Tryptic Soy Agar，TSA）、胰蛋白大豆肉湯（Tryptic Soy Broth，TSB）為BD公司產品；煙酰胺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NAD）為 Amresco公司產品，購自北京百靈克生物技術有限公司，TSA或TSB培養(yǎng)基在使用前均加入終濃度為50 μg/mL的NAD和10%的新生牛血清；濃鹽酸、無水乙酸鈉、無水乙醇、苯酚等均為分析純，購自北京市國藥集團；L-鼠李糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、D-果糖、D-甘露糖、D-半乳糖等標準單糖，均為Sigma公司產品，購自上?；瘜W試劑有限公司，分子量為 4.32 Ku、12.6 Ku、60.6 Ku、110 Ku、410 Ku的葡聚糖標準品，購自中國計量研究所，LC-10A液相色譜儀，購自日本島津有限公司；Nucleosil C18 1005-5NH2 4.6×250mm色譜柱，購自上海優(yōu)其實業(yè)有限公司，Shodex sugar KS-804凝膠色譜柱，購自迪馬科技有限公司；Heidolp旋轉蒸發(fā)儀，購自北京康高特科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 副雞禽桿菌的培養(yǎng) Apg在帶有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，TSA固體培養(yǎng)傳種2代，取多個菌落進行液體培養(yǎng)，在生長9～12 h能達到最佳對數(shù)生長期。

1.3.2 Apg B型分離株莢膜染色 運用Anthong莢膜染色法進行[6]，具體操作步驟是：加1滴無菌水于載玻片上，從固體培養(yǎng)基上挑少量對數(shù)生長期的菌苔涂成薄層風干，1%結晶紫水溶液染2 min，20%硫酸銅沖洗，吸水紙吸干，立即加1～2滴香柏油于涂片處，顯微鏡鏡檢。

1.3.3 Apg莢膜多糖提取及純化 按3%的比例接種培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，37℃恒溫箱進行攪拌培養(yǎng)，達到對數(shù)生長期終止培養(yǎng)，收集10 L TSB液體培養(yǎng)的菌液，用0.25%甲醛滅活后離心去除菌體，上清液濃縮加入適量乙酸鈉和中濃度為25%的無水乙醇，以去除核酸沉淀，4℃過夜后離心收集上清，加入適量乙酸鈉和80%無水乙醇完全沉淀粗多糖，4℃過夜離心[7]。去除雜蛋白：沉淀用0.3 mol/L乙酸鈉溶液溶解，以等體積苯酚-乙酸鈉飽和液離心抽提，此步驟重復4次[8]。吸取上清液用蒸餾水透析去除殘存苯酚，透析后內液加入適量乙酸鈉和80%無水乙醇以沉淀多糖，用無水乙醇及丙酮各洗2次，凍干所收獲的多糖，稱量并進行鑒定及分析。

1.3.4 葡萄糖標準曲線的制備 精確稱取無水葡萄糖0.5 g，蒸餾水定容至1 L，取10只具塞試管，分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，各加水補至2.0 mL，加入6%苯酚溶液1.0 mL及濃硫酸5 mL，搖勻，放置沸水中15 min，取出再放入冷水中，20 min后在波長490 nm處測定吸光度，以蒸餾水做空白對照，以葡萄糖毫克數(shù)為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線[9]。

1.3.5 多糖含量的測定 精確稱取莢膜多糖粗制品85 mg，加入1 mL蒸餾水配制儲存溶液，使用時稀釋30倍制成多糖樣品溶液。取制備好的樣品溶液1.0 mL，加入蒸餾水補至2.0 mL，加入6%苯酚溶液1.0 mL及濃硫酸5 mL，搖勻，放置沸水中15 min，取出再放入冷水中，20 min后在波長490 nm處測定吸光度，同時做3個重復。根據公式：多糖含量（%）＝［（C×D×F）÷W］×100% 計算多糖在樣本中的含量。C為多糖樣品溶液的濃度（mg/mL），D為樣品的稀釋倍數(shù)；F為換算因子（國際F=3.19），W樣為樣品重量。

1.3.6 莢膜多糖的單糖組分分析 稱取干燥10 mg樣品放入安瓶加入3 mol/L鹽酸5 mL封口80℃水解8 h。將水解后的多糖離心過濾去雜質濃縮，色譜分析用1 mL蒸餾水溶解，進樣10 μL，根據標準單糖與樣品的保留時間的比較確定組成單糖的種類。

1.3.7 多糖分子量測定 稱取干燥樣品10 mg用1 mL蒸餾水溶解，離心過濾去雜質，進樣5 μL液相色譜分析，已知標準品分子量和出現(xiàn)波峰時間，對照樣品出現(xiàn)波峰時間來計算出分子量的大小[10]。

2 結果分析

2.1 Apg B型分離株莢膜染色 莢膜染色結果見圖1所示，在圖中能清楚看到細菌的細胞壁外包圍有一層黏性物質，表明體外培養(yǎng)狀態(tài)下副雞禽桿菌是有莢膜的。

2.2 經凍干后稱量并計算，粗提Apg莢膜多糖的提取得率為85 mg/L。

2.3 標準曲線的測定 配制好的葡萄糖標準溶液按照不同劑量分別吸出，在加入蒸餾水補齊至2.0 mL，按上述苯酚-硫酸比色法操作，得到不同吸光值。以吸光值為縱坐標，糖濃度為橫坐標繪制標準濃度曲線，結果見表1。由表1得出葡萄糖標準曲線圖，如圖2。

表1 不同濃度葡萄糖的吸光值

2.4 粗提物中多糖含量 根據表1，圖2標準曲線得出回歸方程:y=1.3339X+0.0227，R2=0.994。y為吸光度，X為多糖濃度（mg/mL）。根據葡萄糖標準曲線可以看出在0.0～0.9 mg呈現(xiàn)良好的線性關系。提取莢膜多糖濃度使用回歸方程來計算。莢膜多糖在OD490處測得3次吸收值，取其平均數(shù)為0.728，將該平均值帶入回歸方程得出莢膜多糖樣品的濃度為0.529 mg/mL。依據公式：多糖含量（%）＝［（C×D×F）÷W］×100%＝［（0.529×30×3.19）÷85］×100%，得出莢膜多糖的含量為59.6%。

2.5 多糖的單糖組分構成 液相色譜分析單糖構成結果見圖3。從圖3-A標準品單糖出峰時間和峰面積對比，圖3-B圖樣品出峰時間和面積，可以確定Apg B型分離株莢膜多糖主要由L-鼠李糖、D-木糖、D-葡萄糖組成，圖3-B圖第一個峰為未知糖。

2.6 多糖分子量 分子量測定結果見圖4。其中圖4A從左到右的波峰依次對應分子量為410 Ku、110 Ku、60.6 Ku、12.6 Ku、4.32 Ku，依據標準品分子量大小和其出現(xiàn)波峰的時間，對照B圖樣品出現(xiàn)波峰時間來計算樣品多糖的分子量。本試驗中所測樣品多糖的分子量約為209 Ku左右，圖4C是A圖標準分子量曲線圖，橫軸為標準品所用時間，縱軸為分子量大小。

3 討論

關于副雞禽桿菌莢膜多糖的研究鮮有報道，早在1981年Iritani等研究發(fā)現(xiàn)，該菌的粗提多糖含有兩種成分，并對這兩種成分做了相關的活性分析，證實這些成分具有保護活性和型特異性。直到2010年，臺灣也有關于副雞禽桿菌莢膜化學成分的分析，該研究主要發(fā)現(xiàn)了外膜基因序列存在兩種基因型[5]，而本文提取純化了副雞禽桿菌的莢膜多糖并首次對其含量、組分、分子量大小作了初步研究。

確定莢膜存在是進行分析鑒定的前提。莢膜染色方法各不相同，要有摸索過程。開始使用墨汁染色法造成莢膜效果不是很理想，最終選擇Anthong莢膜染色法操作更為簡便，莢膜清晰可見并可觀察到莢膜的自然形態(tài)，此方法操作簡便省時高效，值得推廣[6]。冷酚蛋白抽提次數(shù)增加多糖含量會逐漸降低，抽提5次以上會使莢膜多糖化學結構受到損傷導致多糖指標不合格[7]，抽提1～2次雜質去除不徹底多糖指標不合格，定為4次為最佳抽提條件。本文多糖含量測定，用苯酚-硫酸比色法具有簡單快速無需多糖純品和貴重儀器等優(yōu)點，此法測定多糖含量其重復性和穩(wěn)定性好[11-12]。

本試驗運用高效液相色譜分析Apg莢膜多糖的組分，由于沒有相應的標準單糖，目前還無法確定圖3B中出現(xiàn)的第一個峰對應的是哪一種單糖，仍需再進一步的研究加以確定。

本研究應用高效液相色譜分析了多糖的分子量。同條件下分子量越大出峰越早，根據標準葡聚糖出峰時間和分子量大小的對應關系，來計算出樣品出峰時間分子量。在檢測過程中，樣品的純度跟出現(xiàn)的峰是密切相關的，過多雜質會導致試驗結果不理想。

據報道莢膜多糖是細菌中毒力的主要成分之一，但是提取純化后的莢膜多糖只是半抗原，免疫原性弱，往往需要與其他蛋白偶聯(lián)后才能發(fā)揮免疫作用。有文獻[13]報道，莢膜多糖與菌體蛋白質聯(lián)合粗提物的免疫原性明顯高于莢膜多糖本身。因此選擇較為簡單的粗提法，可使?jié)饪s物能夠保持免疫原性，同時也可以在生產過程中降低成本。本研究對探索副雞禽桿菌亞單位疫苗的可行性提供了一定的參考。

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