復(fù)方中藥合劑對(duì)雞紅細(xì)胞免疫功能的影響

靳雙星，張桂枝

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院畜牧工程系，河南 鄭州 450011）

動(dòng)物的紅細(xì)胞與白細(xì)胞一樣，具有重要的免疫功能，其基礎(chǔ)是紅細(xì)胞表面具有C3b受體（C3bR）。紅細(xì)胞可通過(guò)其表面的C3bR，發(fā)揮清除免疫復(fù)合物（IC）、促進(jìn)吞噬、提呈抗原及激活補(bǔ)體等多種作用[1]。研究表明，許多中草藥可增強(qiáng)紅細(xì)胞免疫吸附能力，減少異物對(duì)機(jī)體的危害[2-8]。前期研究表明，自擬的復(fù)方中藥合劑能促進(jìn)免疫器官的發(fā)育，增強(qiáng)疫苗的免疫效果，提高熱應(yīng)激下肉仔雞的生長(zhǎng)性能，增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力，提高機(jī)體抗氧化水平。本試驗(yàn)旨在探討飲水中添加復(fù)方中藥合劑，對(duì)肉仔雞紅細(xì)胞免疫功能的影響，為該制劑的臨床推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品 復(fù)方中藥合劑由連翹、黃芪、板藍(lán)根、茯苓、白術(shù)、枳實(shí)、山楂、甘草8味中藥組成。連翹采用醇提法提取連翹提取物；白術(shù)、枳實(shí)采用蒸餾法提取揮發(fā)油，濾液與黃芪、茯苓、甘草、山楂、板藍(lán)根混合水煎2次，合并上述濾液濃縮至比重1.10（溫度60℃）、加入乙醇使其沉淀，濾過(guò)；濾液與連翹提取物混合，加入白術(shù)、枳實(shí)揮發(fā)油及吐溫-80，加入30%蔗糖，調(diào)節(jié)藥物濃度至1∶1，并調(diào)節(jié)pH值至中性，滅菌備用。

1.2 材料與試劑 離心機(jī)、恒溫水浴箱、顯微鏡、計(jì)數(shù)器、小離心管、血細(xì)胞計(jì)數(shù)管。酵母試劑、Hank′s液、家兔血清、瑞氏-姬姆薩染液等。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì) 1日齡健康A(chǔ)A肉仔雞，隔離飼養(yǎng)至7日齡，選取120只體重相近健康的肉仔雞（雌雄各半），隨機(jī)分為3組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞，分籠飼養(yǎng)。A組作為空白對(duì)照組，不進(jìn)行新城疫活疫苗免疫；B、C兩組均在7日齡2倍量點(diǎn)眼滴鼻接種新城疫活疫苗LaSota株，B組正常飲水，C組接種疫苗的同時(shí)在飲水中添加1.0%復(fù)方中藥合劑，連續(xù)用藥7 d。在14、21、28日齡和35日齡時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)抽取2只雞，每組8只雞，心臟采集血液，1%肝素抗凝，待檢。

1.4 紅細(xì)胞C3b受體（RBC-C3bR）花環(huán)率檢測(cè)

1.4.1 C3b致敏酵母懸液制備 將酵母試劑用Hank′s液（pH值7.2）洗1次（1 000 r/min離心10 min），配成含酵母細(xì)胞1.0×108/mL的懸液，加等量新鮮家兔血清，混勻，37℃水浴20 min。然后再以Hank′s液洗2次，恢復(fù)原濃度，即為C3b致敏酵母細(xì)胞懸液。

1.4.2 紅細(xì)胞懸液制備 分別將上述各時(shí)間采集的肝素抗凝血2 000 r/min離心10 min，吸出上清液 (血漿 )，用Hank′s液洗3次（每次以2 000 r/min離心5 min），最后將紅細(xì)胞用Hank′s液稀釋成1.25×107細(xì)胞/mL的懸液。

1.4.3 檢測(cè)方法 取C3b致敏酵母懸液和紅細(xì)胞懸液各50 μL，混勻，于37℃水浴40 min后取出，輕輕搖起，加0.25%戊二醛溶液20 μL固定5 min，用適量Hank′s液稀釋，涂片，干燥，甲醇固定，用瑞氏-姬姆薩染液染色，高倍鏡檢查。以1個(gè)紅細(xì)胞粘附2個(gè)或2個(gè)以上酵母細(xì)胞為1個(gè)花環(huán)，計(jì)數(shù)200個(gè)紅細(xì)胞，計(jì)算出花環(huán)率：RBC-C3bR花環(huán)率=RBC-C3bR花環(huán)數(shù)/200×100%。

1.5 紅細(xì)胞免疫復(fù)合物(RBC-IC)花環(huán)率檢測(cè) 除酵母細(xì)胞不致敏外，其余同RBC-C3bR花環(huán)率檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0中One-Way ANOVA過(guò)程進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)行Duncan′s多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方中藥合劑對(duì)肉仔雞RBC-C3bR花環(huán)率的影響 由表1結(jié)果可知 ，A、B、C組之間，RBC-C3bR花環(huán)率的形成明顯不同。免疫后第7天（即14日齡），C組高于空白對(duì)照A組，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；B組顯著低于A組（P＜0.05）；C組極顯著高于B組（P＜0.01）。免疫后第14天（即21日齡），B組高于A組，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；C組極顯著高于A、B組（P＜0.01）。免疫后第21天（即28日齡），B組顯著高于A組（P＜0.05），C組極顯著高于A、B組（P＜0.01）。免疫后第28天（即35日齡），C組極顯著高于A組（P＜0.01），顯著高于B組（P＜0.05）。

表1 復(fù)方中藥合劑對(duì)肉仔雞RBC-C3bR花環(huán)率的影響

2.2 復(fù)方中藥合劑對(duì)肉仔雞RBC-IC花環(huán)率的影響 由表2結(jié)果可知 ，A、B、C組之間，RBC-IC花環(huán)率的形成明顯不同。免疫后第7天（即14日齡），C組顯著高于A組（P＜0.05），極顯著高于B組（P＜0.01）；B組顯著低于A組（P＜0.05）。免疫后第14天（即21日齡），C組極顯著高于A、B組（P＜0.01），A組與B組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。免疫后第21天（即28日齡），C組極顯著高于 A、B組（P＜0.01），B組顯著高于 A組（P＜0.05）。免疫后第28天（即35日齡），C組極顯著高于A組（P＜0.01），顯著高于B組（P＜0.05）。

3 討論

表2 復(fù)方中藥合劑對(duì)肉仔雞RBC-IC花環(huán)率的影響

紅細(xì)胞膜上已明確的補(bǔ)體受體有I型補(bǔ)體受體（CR1）和Ⅲ型補(bǔ)體受體（CR3）。CR1由 Fearon于1979年首次分離，是紅細(xì)胞免疫的重要基礎(chǔ)。目前認(rèn)為，絕大多數(shù)C3b免疫復(fù)合物(C3b-IC)可與CR1連接。CR1廣泛存在于紅細(xì)胞、多形核白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及T、B淋巴細(xì)胞膜的表面。不同細(xì)胞所含CR1數(shù)量不同[9]，其中紅細(xì)胞為950個(gè)，B細(xì)胞為2 100個(gè)，多形核白細(xì)胞為57 000個(gè)，單核細(xì)胞為48 000個(gè)。盡管單個(gè)白細(xì)胞表面CR1較紅細(xì)胞多，但由于血液中紅細(xì)胞總數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)白細(xì)胞總數(shù)，并且循環(huán)系統(tǒng)中約95%的C3b受體位于紅細(xì)胞膜上，所以紅細(xì)胞與循環(huán)免疫復(fù)合物結(jié)合的機(jī)率是白細(xì)胞的500～l 000倍。因此，體內(nèi)對(duì)免疫復(fù)合物的清除起主要作用的是紅細(xì)胞而不是白細(xì)胞[1，9-10]。

紅細(xì)胞粘附的免疫復(fù)合物隨血流被帶到固定吞噬系統(tǒng)(如肝、脾)。固定吞噬系統(tǒng)捕獲紅細(xì)胞結(jié)合的免疫復(fù)合物后，通過(guò)巨噬細(xì)胞膜表面的Fc受體與免疫復(fù)合物中Fc段結(jié)合。此時(shí)，紅細(xì)胞從免疫復(fù)合物上解離，再度進(jìn)入循環(huán)，而捕獲了免疫復(fù)合物的巨噬細(xì)胞則通過(guò)膜表面的CR1受體再與免疫復(fù)合物的補(bǔ)體C3b結(jié)合，F(xiàn)c受體與CR1受體的協(xié)同作用使巨噬細(xì)胞的吞噬作用加強(qiáng)，將免疫復(fù)合物吞噬，并清除出體內(nèi)。

紅細(xì)胞的粘附活性可作為評(píng)價(jià)紅細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)。郭峰等建立了簡(jiǎn)易的紅細(xì)胞C3b受體酵母花環(huán)試驗(yàn)與紅細(xì)胞免疫復(fù)合物酵母花環(huán)試驗(yàn)，用于測(cè)定RBC-C3bR花環(huán)率和RBC-IC花環(huán)率。RBC-C3bR花環(huán)率和RBC-IC花環(huán)率高低可作為紅細(xì)胞免疫粘附功能的指標(biāo)。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，健康雞經(jīng)新城疫活疫苗免疫后，RBC-C3bR花環(huán)率和RBC-IC花環(huán)率與空白對(duì)照組相比短暫顯著降低，說(shuō)明用新城疫活疫苗免疫會(huì)引起機(jī)體紅細(xì)胞免疫功能短暫性下降，與喬海博等試驗(yàn)結(jié)果一致[11]，這可能是新城疫活疫苗毒株進(jìn)入機(jī)體后破壞血液中紅細(xì)胞膜上的C3b受體所致。紅細(xì)胞C3b受體分子是分子量約為200 000的糖蛋白，極易受到各種抗原的危害。飲水中添加復(fù)方中藥合劑，在不同日齡均能不同程度提高RBC-C3bR花環(huán)率和RBC-IC花環(huán)率，與疫苗對(duì)照組相比存在顯著或極顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）。說(shuō)明復(fù)方中藥合劑能顯著提高紅細(xì)胞的免疫功能，并能克服因接種疫苗引起紅細(xì)胞免疫功能短暫下降的不良反應(yīng)。

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