合歡皮總皂苷提取工藝優(yōu)化

王巧文，錢(qián)澤秀，孫紅祥

(浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州310058)

合歡皮(Cortex Albizziae)為豆科植物合歡(Albizziajulibrissin Durazz.)的干燥莖皮，其味甘、性平，具安神解郁、活血消腫功，主治心神不安、躁動(dòng)不安、跌打損傷和愴惶療毒等癥［1］。合歡皮含有三萜皂苷、生物堿、黃酮類(lèi)、木脂素、多糖等多類(lèi)化學(xué)成分，其中三萜皂苷是合歡皮的主要有效成分，具有廣泛的生理活性和藥理作用，如抗抑郁、抗生育、抗氧化、抗糖尿病、抗菌、保肝、抗血管生成、抗腫瘤、抗菌和免疫調(diào)節(jié)等［2-4］。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)合歡皮總皂苷對(duì)禽流感–新城疫重組二聯(lián)活疫苗［5-6］、豬偽狂犬病弱毒疫苗［7］、豬 O 型口蹄疫滅活疫苗［8］等商品疫苗均具有顯著的佐劑作用，并在靶動(dòng)物上得到了證實(shí)。為了建立科學(xué)、合理的提取工藝，進(jìn)一步促進(jìn)合歡皮總皂苷作為疫苗佐劑新獸藥的研究與開(kāi)發(fā)，試驗(yàn)根據(jù)合歡皮中皂苷的理化性質(zhì)，建立了以齊墩果酸為對(duì)照品，分光光度法測(cè)定含量的方法，并采用單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)方法，以總皂苷收率為指標(biāo)，對(duì)醇提工藝乙醇濃度、乙醇用量、提取時(shí)間和提取次數(shù)進(jìn)行考察，優(yōu)選合歡皮總皂苷的提取工藝。

1 儀器與試劑

1.1 儀器與設(shè)備 TU-1800PC型紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);Sartorious 1700型電子天平(W-Germany);DK-S26型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);W501型恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司);R502B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司);SHB-Ш循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);DLSB低溫冷卻液循環(huán)泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)。

1.2 試劑 合歡皮絲，浙江省景岳堂藥業(yè)有限公司，批號(hào):13073103;齊墩果酸對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院 (110709-200304);試驗(yàn)用水為超純水;所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總皂苷含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取干燥至恒重的齊墩果酸對(duì)照品11.0 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。取10 mL于50 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得濃度為0.044 mg/mL的齊墩果酸對(duì)照品溶液。

2.1.2 樣品溶液制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g合歡皮絲，置于500 mL圓底燒瓶中，按實(shí)驗(yàn)設(shè)置的處理?xiàng)l件提取。提取液濾過(guò)，合并濾液，減壓回收乙醇、以超純水調(diào)整體積至50 mL。取20 mL經(jīng)等體積乙醚萃取3次脫脂后，以等體積水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，減壓回收溶劑、濃縮至干，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，精密吸取0.5 mL于10 mL容量瓶并定容，混勻，即得樣品溶液。

2.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 精密吸取對(duì)照品溶液2.0 mL和樣品溶液0.5 mL，分別置于10 mL刻度螺紋試管中，70℃恒溫水浴加熱蒸干。精密加入5%香草醛–冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，密封，60℃水浴反應(yīng)15 min，冰浴冷卻10 min，再精密加入5 mL冰醋酸，搖勻。以空白試劑做參比，用TU-1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，于400～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。結(jié)果齊墩果酸和樣品溶液均在550 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇550 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 至10 mL 刻度試管中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，以空白試劑做參比，按紫外分光光度法于550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度［1］。以吸光度A為縱坐標(biāo)、齊墩果酸濃度C(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程為:A＝0.0418C+0.0022(r＝0.9991)。可見(jiàn)，齊墩果酸在每mL含3.67～18.33 μg的濃度范圍內(nèi)，其濃度與吸光度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取樣品溶液5份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，于550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，RSD為0.10%(n＝5)，表明該方法精密度良好。

2.1.6 樣品溶液穩(wěn)定性 精密吸取樣品溶液0.5 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，分別顯色后0、5、10、15、20、25、30 min，于 550 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果吸光度基本一致，RSD為0.20%(n＝6)，說(shuō)明樣品溶液顯色后30 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥材6份，分別按“樣品溶液制備”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算總皂苷含量，RSD為0.92%(n＝6)，說(shuō)明重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一批藥材6份，加入不同量的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，按“樣品溶液制備”項(xiàng)下制備樣品溶液，“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果平均回收率為100.33，RSD為1.50%(n＝6)?？梢?jiàn)，本方法能準(zhǔn)確地測(cè)定合歡皮總皂苷含量。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度考察 準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g合歡皮絲，置于500 mL圓底燒瓶。恒定回流時(shí)間2 h、提取次數(shù)3次、提取溶劑用量12倍的條件下，分別用質(zhì)量濃度50%、60%、70%和80%乙醇進(jìn)行提取。按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定總皂苷含量，計(jì)算總皂苷收率(mg/g)，結(jié)果見(jiàn)圖1。隨著乙醇濃度的增加，合歡皮總皂苷收率呈先增大后減小。因此，選擇60%、70%、80%作為正交試驗(yàn)中乙醇濃度的3個(gè)水平。

2.2.2 乙醇用量考察 準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g合歡皮絲，置于500 mL圓底燒瓶。恒定回流時(shí)間2 h、提取次數(shù)3次、乙醇濃度70%的條件下，分別以藥材量的6、8、10和12倍的乙醇進(jìn)行提取。按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定總皂苷含量，計(jì)算總皂苷收率(mg/g)，結(jié)果見(jiàn)圖2。隨著乙醇用量倍數(shù)的增加，總皂苷收率呈增加的趨勢(shì)。因此，選擇10、12、14倍作為正交試驗(yàn)中乙醇用量的3個(gè)水平。

圖1 乙醇濃度對(duì)總皂苷收率的影響

圖2 乙醇用量對(duì)總皂苷收率的影響

2.2.3 提取時(shí)間考察 準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g合歡皮絲，置于500 mL圓底燒瓶。恒定提取次數(shù)為3次、乙醇濃度70%、乙醇用量12倍的條件下，按每次提取時(shí)間分別為1、1.5、2、2.5 h 進(jìn)行提取。按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定總皂苷含量，計(jì)算總皂苷收率(mg/g)，結(jié)果見(jiàn)圖3。2 h以?xún)?nèi)隨著提取時(shí)間的增加，總皂苷收率呈增加的趨勢(shì)，然而再延長(zhǎng)提取時(shí)間差異不顯著。因此，選擇1、1.5和2 h作為正交試驗(yàn)中提取時(shí)間的3個(gè)水平。

2.2.4 提取次數(shù)考察 準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g合歡皮絲，置于500 mL圓底燒瓶。恒定回流時(shí)間為2 h、乙醇濃度70%、用量12倍的條件下，分別提取1次、2次、3次和4次。按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定總皂苷含量，計(jì)算總皂苷收率(mg/g)，結(jié)果見(jiàn)圖4，提取2次總皂苷收率顯著高于1次，而2次、3次和4次之間總皂苷收率差異不顯著。考慮到提取次數(shù)增多增加能耗，且2次基本提盡總皂苷。因此，在正交試驗(yàn)中固定提取次數(shù)為2次。

圖3 提取時(shí)間對(duì)總皂苷收率的影響

圖4 提取次數(shù)對(duì)總皂苷收率的影響

2.3 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇影響合歡皮總皂苷收率因素中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的水平做正交試驗(yàn)，采用 L9(34)正交試驗(yàn)表考察最佳工藝條件。正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析表

由表2極差R的數(shù)據(jù)分析可知:各因素的影響程度依次為B＞C＞A，即乙醇濃度＞提取時(shí)間＞乙醇用量。方差分析結(jié)果表明:B因素(乙醇濃度)對(duì)總皂苷收率有顯著的影響(P＜0.01)，而A(乙醇用量)和C(提取時(shí)間)因素?zé)o顯著性影響(P＞0.05)，以A3B2C3組合為佳，即乙醇用量14倍、乙醇濃度70%和提取時(shí)間2 h。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 取同一批藥材，按上述確定最佳組合A3B2C3進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。A3B2C3工藝提取的總皂苷平均收率為8.617 mg·g-1，RSD＝0.115%(n＝3)。驗(yàn)證試驗(yàn)合歡皮總皂苷收率高于正交試驗(yàn)中各次的結(jié)果，說(shuō)明該提取工藝合理、穩(wěn)定、可行。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

合歡皮中皂苷化合物種類(lèi)多，化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜。目前分離得到的40多個(gè)化合物多為齊墩果烷型苷元與8～9個(gè)單糖分子以及二分子單萜烯酸(辛二烯酸衍生物)結(jié)合而成的一系列分子量在2000左右的三萜皂苷，包括單糖鏈、雙糖鏈和三糖鏈［4］。目前文獻(xiàn)報(bào)道的合歡皮總皂苷含量測(cè)定方法包括紫外分光光度法［9］和 HPLC法［10］。由于合歡皮中皂苷化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)具有極大的相似性，分離純化十分困難，目前尚無(wú)法定的合歡皮皂苷標(biāo)準(zhǔn)品。鑒于合歡皮中皂苷多為齊墩果烷型皂苷，上述二種定量方法均選用齊墩果酸為對(duì)照品。HPLC法需先通過(guò)酸水解將皂苷水解成苷元，然后檢測(cè)齊墩果酸［10］。此法操作復(fù)雜繁瑣，且合歡皮皂苷有多種苷元。紫外分光光度法所需設(shè)備及操作簡(jiǎn)單，易普及推廣，靈敏度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性較高，應(yīng)用范圍廣。因此，本文采用紫外分光光度法，對(duì)文獻(xiàn)方法［9］作了改進(jìn)，并進(jìn)行了方法學(xué)考察。證實(shí)該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，可行性良好。

有關(guān)合歡皮皂苷制備工藝，施建軍等［10］曾以干粉得率、總苷含量、對(duì)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞的IC50值為指標(biāo)，選取乙醇濃度、回流時(shí)間、提取次數(shù)、萃取次數(shù)四種因素，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化了乙醇回流–水飽和正丁醇萃取工藝路線(xiàn)，得到了最優(yōu)提取路線(xiàn)為用70%的乙醇，提取2次，每次回流3 h，最后用正丁醇萃取4次。該工藝使用的正丁醇沸點(diǎn)高，回收困難，不利于大生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)室前期篩選得到的具有佐劑活性的合歡皮總皂苷采用適于工業(yè)化大生產(chǎn)的乙醇回流–大孔樹(shù)脂洗脫工藝路線(xiàn)制備。試驗(yàn)選擇對(duì)合歡皮皂苷提取影響較大的乙醇濃度、乙醇用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)四個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定正交試驗(yàn)的因素和水平設(shè)置。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)法優(yōu)選合歡皮總皂苷的最佳提取工藝條件，即乙醇用量14倍、濃度乙醇70%、提取2次、每次2 h，得到的合歡皮總皂苷收率為 8.617 mg·g-1。

該提取工藝操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、可行，為合歡皮總皂苷后續(xù)的純化、以及合歡皮總皂苷作為疫苗佐劑新獸藥的研究與開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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