脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)材料對(duì)大鼠顱骨缺損修復(fù)的研究*

李伯翰 劉洪臣

口腔頜面部的腫瘤、外傷、發(fā)育性畸形均易造成頜骨缺損。骨缺損的修復(fù)技術(shù)主要有自體骨移植、異體(同種或異種)骨移植和人工骨材料移植。自體骨移植雖為目前骨缺損修復(fù)的金標(biāo)準(zhǔn)[1,2]，但存在取骨區(qū)多種并發(fā)癥、骨量有限、吸收不良等問題[3-5]。為此，很多學(xué)者為尋找一種優(yōu)良的骨替代材料進(jìn)行了大量的研究。

近年來研究較多的脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)(demineralized dentin matrix，DDM)是一種具有骨誘導(dǎo)性的骨替代材料[6-9]。本實(shí)驗(yàn)選用的材料主要成分為DDM-熟石膏(Ca[SO4]-0.5H2O)復(fù)合構(gòu)建新的組織工程骨，用于修復(fù)骨缺損，探討此種新型植骨材料的骨缺損修復(fù)作用，希望為臨床治療骨缺損提供一種新型的人工骨材料。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑、儀器 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6-8周齡雄性SD大鼠14只(SPF/VAF，解放軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，體重160-180 g。熒光顯微鏡、倒置顯微鏡(Leica公司，德國(guó))。

1.2 脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)牙粉制備 取8周齡SD大鼠兩只的上下前牙，用預(yù)冷的生理鹽水反復(fù)沖洗后，刮除軟組織，機(jī)械法去除牙釉質(zhì)和牙骨質(zhì)以及內(nèi)部牙髓組織，用三氯甲烷-甲醇脫脂24h，然后將脫礦、脫脂的牙齒粉碎過篩制成200-280μm的微粒，用預(yù)冷生理鹽水反復(fù)沖洗，放入pH為8.0的5g/L的EDTA液中處理10min，生理鹽水沖洗12h去除EDTA后，環(huán)氧乙烷消毒，備用。純二水硫酸鈣經(jīng)加熱1300℃,30 min鍛燒而得熟石膏。以脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)和熟石膏按2：1的重量比混合后環(huán)氧乙烷消毒保管[10-12]。

1.3 手術(shù)方法 用乙醚進(jìn)行全麻后，腹腔內(nèi)注入戊巴比妥鈉25mg/kg完全麻醉SD大鼠，麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)上，頭顱部備皮和碘伏消毒后為了減少術(shù)中出血注射20/0鹽酸利多卡因(含1：10萬復(fù)方腎上腺素)，切開頭顱骨正中央部并露出骨面。用臺(tái)式慢速牙科電鉆低速鉆孔(3000r/min)直徑約為8mm。實(shí)驗(yàn)組：立即將己準(zhǔn)備好的脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)牙粉末和熟石膏以2：1的質(zhì)量比用生理鹽水混合后埋植到缺損部?？p合骨膜及上部組織。對(duì)照組：無治療修復(fù)，手術(shù)后立即縫合。待蘇醒后送回飼養(yǎng)室，分別于術(shù)后第4和8周(實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各3只)時(shí)分組處死動(dòng)物。各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用吸入過量乙醚的方式處死后切開頭部，在70kvp、15ml、0.4sec的條件下攝X線片，之后采集標(biāo)本(包括周圍自體骨)，10%的福爾馬林固定，脫鈣，用石蠟包埋后以4-6μm的厚度制作組織標(biāo)本。用H-E染色法染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 觀察指標(biāo) (1)肉眼觀察術(shù)后大鼠活動(dòng)、進(jìn)食、傷口愈合情況。(2)分別于術(shù)后4和8 w，將大鼠麻醉后攝大鼠顱骨X線片，條件為40kV，1.6 mAs觀察顱骨缺損修復(fù)情況;然后在麻醉狀態(tài)下注入空氣處死，取標(biāo)本行肉眼觀察及HE染色組織學(xué)觀察骨缺損的修復(fù)水平。

2.結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察 術(shù)后動(dòng)物體溫、飲食正常，外界環(huán)境刺激敏感，切口無紅腫、滲液等炎性反應(yīng)。

2.2 影像學(xué)檢查 實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間段均可見云霧樣改變，缺損邊緣隱約可見少量骨痂;8W時(shí)云霧模糊影較大，缺損處有骨形成充滿骨痂?？瞻捉M在各時(shí)間點(diǎn)，骨折缺損處見有瘢痕愈合，未見骨性愈合，未見明顯新生骨(圖1)。

圖1 顱骨缺損后修復(fù)影像學(xué)檢查

2.3 大體觀察 各組植入的修復(fù)材料在骨創(chuàng)區(qū)均無移位，材料于骨組織交界周圍未見變性、壞死、化膿、積液等不良跡象。4 w時(shí)，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)骨質(zhì)較薄的骨痂樣硬組織，標(biāo)本表面較為光滑，漸變暗紅色；對(duì)照組缺損區(qū)無明顯新骨長(zhǎng)入，僅有少量結(jié)蹄組織覆蓋。8 w時(shí)，實(shí)驗(yàn)組骨創(chuàng)區(qū)呈現(xiàn)乳白色，可見血管，新生出皮質(zhì)骨與骨折端皮質(zhì)連續(xù)，骨修復(fù)完成;對(duì)照組仍有明顯的骨缺損，骨缺損區(qū)被周圍結(jié)締組織覆蓋，未見明顯骨痂。

2.4 組織學(xué)觀察 4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組脫鈣后均可見空腔，植入材料和缺損處鏈接緊密。各組材料均可見微血管和成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)，對(duì)照組的血管和細(xì)胞數(shù)量少于實(shí)驗(yàn)組。8周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組較多骨樣組織形成，表現(xiàn)為軟骨成骨和纖維成骨特征。對(duì)照組，變化不大，少許局灶性骨樣組織形成。值得關(guān)注的是，對(duì)照組成骨主要表現(xiàn)是從缺損邊緣向中間發(fā)展，而實(shí)驗(yàn)組的成骨活動(dòng)是在材料與缺損邊緣交界處，且更為活躍(圖2)。

3.討論

圖2 組組織學(xué)變化(HE染色，×400)

骨組織工程中，選擇具有細(xì)胞外基質(zhì)作用的生物材料是很重要的，直接關(guān)系到組織再生成功與失敗[13-15]。脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)，按形態(tài)分也有3種，即顆粒狀、凝膠狀和薄膜狀。，其制備和作用機(jī)理在雜志“脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)骨誘導(dǎo)作用的研究”有關(guān)報(bào)道為以臨床拔除的各類牙為原料，經(jīng)過粉碎、脫脂、脫鈣、病毒核酸滅活和消毒等過程獲得，此DDM的顆粒大小為100-200μm3。DDM無論在骨缺損區(qū)、根尖周區(qū)或軟骨區(qū)都具有良好的骨誘導(dǎo)作用，但是DDM的骨誘導(dǎo)機(jī)制目前原因并不十分明確。DDM為天然細(xì)胞外基質(zhì)材料，內(nèi)部含有豐富的有助于細(xì)胞生長(zhǎng)的蛋白和細(xì)胞因子，包括DMP-1，牙本質(zhì)涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)，骨涎蛋白，骨橋蛋白，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-p1、I型膠原，核心蛋白多糖和二聚糖等牙齒基質(zhì)成分，能夠?yàn)榧?xì)胞提供相似天然的牙齒發(fā)育微環(huán)境[15-18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4周后DDM材料和缺損處上游戲包正常貼附、生長(zhǎng)、繁殖，證明該生物材料有良好的細(xì)胞相容性。

人類骨的無機(jī)成分最主要為羥基磷灰石(HA)，我們選用的脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)牙粉材料的主要材料也同樣為羥基磷灰石。但是羥基磷灰石質(zhì)碎，吸收差，不易降解。目前國(guó)內(nèi)外用羥基磷灰石和熟石膏復(fù)合物修復(fù)骨缺損的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一致認(rèn)為:經(jīng)基磷灰石和熟石膏復(fù)合物不引起組織炎性反應(yīng)和異物反應(yīng);羥基磷灰石和熟石膏復(fù)合物誘導(dǎo)新骨形成的速度快于單純羥基磷灰石;新骨與輕基磷灰石的結(jié)合是理想的骨整合[19]。

為彌補(bǔ)脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)牙粉末易離散，早期固位不佳的缺點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)把熟石膏與脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)牙粉末混合后移植，以此提高材料的初期穩(wěn)定性，隨材料穩(wěn)定性的提高，骨傳導(dǎo)能力也可能比單獨(dú)移植脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)牙粉末時(shí)相比優(yōu)越。熟石膏所特有的粘附性，作為脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)牙粉末的粘接成形劑，以保證達(dá)到良好的形態(tài)和固位，減少顆粒的移動(dòng)構(gòu)成一種有效的輸送體系。

本實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果隨著時(shí)間的變化，移植的脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)牙粉末分解成小顆粒，其大小逐漸變小，移植物初期四方形邊緣逐漸變?yōu)閳A鈍，因此可推斷脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)牙粉末是可吸收的，第5周時(shí)可觀察到脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)牙粉末周圍被膜化和骨缺損部位的新骨形成，并且可見到新生毛細(xì)血管;第8周時(shí)受區(qū)骨邊緣可觀察到新骨與脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)牙粉末的直接愈合，新骨滲透到脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)牙粉末的顆粒之間，也觀察到吞噬脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)牙粉末的巨噬細(xì)胞。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)所用的移植材料隨時(shí)間的變化逐漸被吸收，并具有周圍新骨可滲透的骨傳導(dǎo)能力。熟石膏在以往的研究中被認(rèn)為是對(duì)人體無害的、可吸收的、但無骨傳導(dǎo)能力的材料。在本實(shí)驗(yàn)中熟石膏大部分被消失，因此不能進(jìn)行正確的組織學(xué)評(píng)價(jià)，但能觀察到與移植初期相比，隨時(shí)間的變化逐漸被吸收，8周時(shí)幾乎看不到剩余的熟石膏。第3周時(shí)，可觀察到結(jié)締組織內(nèi)的慢性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但第5周時(shí)炎性細(xì)胞明顯減少，凡乎看不到炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

本實(shí)驗(yàn)中使用的脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)牙粉末是同種異體的牙齒，它是在1200℃以上的高溫處理的方法從牙齒中提取無機(jī)物的，因此考慮它無免疫原性，但今后仍需進(jìn)行免疫學(xué)相關(guān)研究。

[1]San Julian M，Valenti A.Bone transplant[J].An Sist Sanit Navar，2006，29(2):125-136

[2]Goldberg VM，Stevenson S.Natural history of autografts and a-llografts[J].Clin Orthop Relat Res，1987，(225):7-16

[3]Le Geros RZ.Properties of osteoconductive biomaterials:calcium phosphates[J].Clin Orthop Relat Res，2002，(395):81-98

[4]張 明，楊智賢，石展英，等.自體骨泥混入骨膜碎片植骨與單純自體骨泥植骨修復(fù)骨缺損的效果對(duì)比實(shí)驗(yàn)[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2006，9(30)：76-79

[5]王丁丁，曾 戎，楊敏兒，等.緩釋型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2/殼聚糖生物骨修復(fù)材料誘導(dǎo)骨形成[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(25)：4583-4586

[6]鮑濟(jì)波，謝志剛.脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)骨誘導(dǎo)作用的研究[J].國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2011，38(3)：329-331

[7]謝 迎，劉 斌，岑遠(yuǎn)坤，等.種植體固定的鈦網(wǎng)復(fù)合脫鈣牙基質(zhì)增高牙槽嵴的研究[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2008，4(22):476-180

[8]岑遠(yuǎn)坤，李 文，廖運(yùn)茂，等.脫鈣牙本質(zhì)基質(zhì)及其復(fù)合物整復(fù)節(jié)段性骨缺損的組織學(xué)觀察華[J].西口腔醫(yī)學(xué)雜志，1998，8(16):263-165

[9]Li J，Yang J，Zhong X，et al Demineralized dentin matrix composite collagen material for bone tissue regeneration[J].J Biomater Sci Polym Ed，2013，24(13):1519-1528

[10]Reis-Filho CR，Silva ER，Martins AB，et al.Demineralised human dentine matrix stimulates the expression of VEGF and accelerates the bone repair in tooth sockets of rats[J].Arch Oral Biol，2012，57(5):469-476

[11]Yagihashi K，Miyazawa K，Togari K，et al.Demineralized dentin matrix acts as a scaffold for repair of articular cartilage defects[J].Calcif Tissue Int，2009，(3):210-220

[12]Gomes MF，Destro MF，Banzi EC，et al.Optical density of bone repair after implantation of homogenous demineralized dentin matrix in diabetic rabbits[J].Braz Oral Res，2008，22(3)：275-280

[13]李伯翰，劉洪臣，鄂玲玲.蛋白質(zhì)組學(xué)在骨質(zhì)疏松癥大鼠頜骨組織差異蛋白篩選和鑒定中的應(yīng)用[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志，2012，2(10):111-114

[14]Gomes MF，Destro MF，Banzi EC，et al.Optical density of bone repair after implantation of homogenous demineralized dentin matrix in diabetic rabbits[J].Braz Oral Res，2008，22(3):275-280

[15]Mora-Rincones OA，Corona-Rodríguez JC，Díaz-Carvajal AL，et al.Aplication of demineralized human bone matrix in the surgical dental fusion treatment.Report of a case[J].Invest Clin，2008，49(2)：239-249

[16]Guo W，He Y，Zhang x，et a1.The use of dentin matrix scaffold and dental follicle cells for dentin regeneration[J].Biomaterials，2009，30(35)：6708-6723

[17]Bakhshalian N，Jalayer T，Shahoon H，et al.Osteopromotive property of allogenic demineralized dentin matrix:a pilot study[J].J West Soc Periodontol Periodontal Abstr,2013，61(2):35-38

[18]王永剛，張曉梅，譚家莉，等.脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)對(duì)人牙髓干細(xì)胞體外增殖、牙向分化能力的影響[J].口腔醫(yī)學(xué)，2012，32(3):230-239

[19]Zhang SM，Liu J，Zhou W，et al.Interfaeialfabrieation and Property of hydroxyap-atite/Polylactide resorbable bone fixation composites[J].Current Applied Physics，2005，5(5):516-518