免疫程序?qū)ωi偽狂犬病毒抗體效價(jià)的影響

摘要：將22頭35日齡健康長白仔豬分為試驗(yàn)組和空白對照組，試驗(yàn)組20頭，空白對照組2頭。按免疫時(shí)間和免疫劑量設(shè)計(jì)不同的免疫程序并免疫試驗(yàn)組仔豬。采集免疫前和首次免疫1個(gè)月后試驗(yàn)仔豬前腔靜脈血液制備血清，采用豬偽狂犬病膠乳凝集試劑盒檢測各試驗(yàn)豬豬偽狂犬病毒抗體效價(jià)，比較不同免疫程序?qū)ωi偽狂犬病毒抗體效價(jià)的影響。結(jié)果表明，試驗(yàn)仔豬免疫前后豬偽狂犬病毒抗體效價(jià)差異極顯著（P<0.01），免疫后偽狂犬病毒抗體效價(jià)在試驗(yàn)仔豬各個(gè)體間差異極顯著（P<0.01）；免疫劑量組A1與A2、A3差異顯著（P<0.05）；免疫時(shí)間組B1與B2、B3差異顯著（P<0.05）；采用非配對雙樣本均值分析，試驗(yàn)組與空白對照組的抗體效價(jià)差異極顯著（P<0.01）。

關(guān)鍵詞：免疫程序；豬偽狂犬病毒；抗體效價(jià)；影響；分析

中圖分類號： S858.285.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0209-02

收稿日期：2013-12-24

作者簡介：楊加瓊（1970—），女，四川犍為人，副教授，研究方向?yàn)樾竽莲F醫(yī)和水產(chǎn)。E-mail：yjq5360409@163.com。豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病毒引起的豬及其他家畜和野生動(dòng)物的一種傳染病，以發(fā)熱、奇癢（豬除外）及腦脊髓炎為其主要特征，豬是該病毒的貯存畜主和傳染源[1]。中國自20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)該病以來，已擴(kuò)至全國三十多個(gè)省市的豬場，其感染引起的母豬流產(chǎn)、弱胎、死胎等對養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。接種疫苗是該病的主要防控措施，但疫苗的安全性及該病毒極易與其野生型毒株重組導(dǎo)致疫苗效果不佳多有報(bào)道[3]；豬場對經(jīng)濟(jì)效益的考慮以及該病毒對母豬繁殖率及仔豬存活率的影響，為該病的高免血清提供了市場空間。各種豬偽狂犬病疫苗的科學(xué)使用相關(guān)學(xué)者已有研究[4]，但針對制備該病的高免血清免疫程序及相關(guān)研究報(bào)道甚少[5]，本研究通過查閱資料及參照臨床經(jīng)驗(yàn)，設(shè)計(jì)系列免疫程序，探討其制備豬偽狂犬病高免血清的科學(xué)免疫程序，為研制豬偽狂犬病高免血清提供技術(shù)支持，也為臨床防控該病進(jìn)行免疫提供借鑒。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1主要儀器和設(shè)備高壓滅菌鍋；恒溫培養(yǎng)箱；4 ℃冰箱；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品）；96孔V型血凝板；離心機(jī)；10 mL一次性注射器；微量移液器等。

1.1.2主要藥品和試劑豬偽狂犬病活疫苗，湖南亞華種業(yè)股份有限公司生物制藥廠生產(chǎn)；豬偽狂犬病活疫苗稀釋液，湖南亞華種業(yè)股份有限公司生物制藥廠生產(chǎn)；偽狂犬病乳膠凝集試驗(yàn)試劑盒，武漢科前動(dòng)物生物制品責(zé)任有限公司生產(chǎn)。

1.1.3豬偽狂犬病待檢血清樣品22頭試驗(yàn)仔豬按照免疫程序免疫豬偽狂犬病毒疫苗后所制備的22份待檢血清樣品及免疫前所制備的22份血清樣品，共44份待檢血清樣品。

1.2試驗(yàn)豬場及試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)豬場為眉山市東坡區(qū)一個(gè)體養(yǎng)豬場；試驗(yàn)動(dòng)物為該養(yǎng)豬場飼養(yǎng)的2窩22頭（其中，一窩12頭，另一窩10頭）35日齡斷乳閹割的長白仔豬，且母豬和仔豬均未免疫過豬偽狂犬病毒疫苗。

1.3試驗(yàn)時(shí)間

20012年12月10日至2013年2月10日。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1試驗(yàn)分組及免疫參考查閱的資料，將22頭試驗(yàn)仔豬分為試驗(yàn)組和對照組，試驗(yàn)組20頭，包括免疫時(shí)間和免疫劑量2個(gè)大組?？瞻讓φ战M仔豬2頭。根據(jù)試驗(yàn)分組及設(shè)計(jì)的免疫程序，采用頸部肌肉注射途徑免疫各組試驗(yàn)仔豬。具體分組及免疫程序見表1。

表1試驗(yàn)分組及免疫程序的設(shè)計(jì)

組別處理試驗(yàn)

頭數(shù)免疫程序（頭份）首免二免三免四免 免疫劑量A14112A23221A33310免疫時(shí)間B141 2B2312B3312對照組2注：首免與二免、二免與三免、三免與四免間隔時(shí)間均為1周。

1.4.2血樣的采集及血清制備采取前腔靜脈采血法。對所有試驗(yàn)仔豬于免疫前及免疫結(jié)束后按1頭5 mL用10 mL規(guī)格一次注射器采集血液，其中，免疫前直接采集，免疫后按免疫程序免疫結(jié)束后1周時(shí)從前腔靜脈采集血液。于4 ℃冰箱自然沉析，取上清液，低速離心，用移液管吸取上清液置15 mL離心管中，貼標(biāo)簽編號，制備出免疫前及免疫后各試驗(yàn)仔豬的待檢血清樣品，-20 ℃冷藏備用。

1.4.3免疫前及免疫結(jié)束后試驗(yàn)仔豬偽狂犬病毒抗體效價(jià)的測定采用豬偽狂犬病膠乳凝集試驗(yàn)試劑盒對免疫前及免疫后各試驗(yàn)仔豬的44份血清樣品進(jìn)行豬偽狂犬病毒血清效價(jià)的檢測。根據(jù)試劑盒說明書，先將制備的被測血清樣品在微量反應(yīng)板上用稀釋液作2倍系列稀釋，各取1滴（約20 μL）依次滴加于玻片上，同時(shí)設(shè)陰性血清和陽性血清對照，隨后各加膠乳抗原1滴，混勻，攪拌并搖動(dòng)1～2 min，在3～5 min內(nèi)觀察。達(dá)到陽性凝集反應(yīng)的血清最高稀釋倍數(shù)，即為血清的抗體效價(jià)。陽性對照：將陽性血清進(jìn)行2倍系列稀釋，取20 μL與等量膠乳抗原進(jìn)行膠乳凝集試驗(yàn)，膠乳抗原與1 ∶64稀釋的陽性血清應(yīng)出現(xiàn)“++”凝集反應(yīng)。陰性對照：陰性血清加抗原后，應(yīng)不發(fā)生凝集反應(yīng)。

2結(jié)果

2.1免疫前及免疫后各試驗(yàn)仔豬豬偽狂犬病毒抗體效價(jià)

對采集的免疫前及免疫后各44份待檢血清樣品用豬偽狂犬病膠乳凝集試劑盒進(jìn)行檢測，測得各試驗(yàn)仔豬免疫前后的豬偽狂犬病毒血清抗體效價(jià)（表2）。結(jié)果表明，試驗(yàn)前各仔豬均未檢測出抗體效價(jià)，個(gè)體間差異不顯著；免疫后，試驗(yàn)個(gè)體間豬偽狂犬病毒抗體效價(jià)差異極顯著（P<0.01）；免疫前與免疫后相比，抗體效價(jià)差異極顯著（P<0.01）。

2.2豬偽狂犬病不同免疫劑量抗體效價(jià)的差異性

免疫劑量組A1與A2、A3差異顯著（P<0.05），A2與A3組差異不顯著，且A1組的抗體效價(jià)最高。

2.3豬偽狂犬病不同免疫時(shí)間抗體效價(jià)的差異性

免疫時(shí)間組B1與B2、B3差異顯著（P<0.05），B2與B3組差異不顯著，且B2、B3組抗體效價(jià)較高。

2.4對照組和試驗(yàn)組豬偽狂犬病抗體效價(jià)的差異性

采用非配對雙樣本均值分析，試驗(yàn)組與對照組仔豬的抗體效價(jià)差異極顯著（P<0.01）。試驗(yàn)組豬偽狂犬病毒的抗體效價(jià)明顯高于未免疫的對照組。

3討論

供試仔豬因母豬和仔豬均未注射過豬偽狂犬疫苗，且最近并未發(fā)生過豬偽狂犬病，在檢測中也未檢測出豬偽狂犬病毒抗體效價(jià)，表明供試豬無母源抗體影響，適用于本試驗(yàn)要求；在免疫后，除對照組外，其余試驗(yàn)豬抗體效價(jià)均有不同程度的升高，表明所作免疫是成功的。

在免疫劑量3個(gè)處理組中，A1組的4頭試驗(yàn)仔豬的抗體效價(jià)均達(dá)到了1 ∶64以上的水平，表現(xiàn)出了較高的抗體水平，而A2、A3組的試驗(yàn)豬抗體效價(jià)雖比免疫前有了較大提高，但與A1組相比至少低1個(gè)梯度。因A1組試驗(yàn)豬在最后一次免疫時(shí)劑量加倍，且在1周后就采血，是否說明經(jīng)多次免疫后，在最后一次免疫加大劑量對抗體效價(jià)提升有很大影響將進(jìn)一步驗(yàn)證。

在免疫時(shí)間組的3個(gè)處理中，B2、B3組的試驗(yàn)豬抗體水平均較B1組高，說明本次試驗(yàn)B2、B3組的免疫程序效果較好。

試驗(yàn)仔豬在免疫后與免疫前，無論是免疫劑量組還是免疫時(shí)間組其豬偽狂犬病毒的抗體水平差異極顯著，但是免疫劑量組抗體平均水平與免疫時(shí)間組抗體水平相比，免疫劑量組抗體水平明顯高于免疫時(shí)間組的平均水平。因免疫劑量組做了3次免疫，而免疫時(shí)間組只做了2次免疫，這是否說明免疫次數(shù)增多會(huì)提高抗體效價(jià)，或者制作高免血清至少要進(jìn)行多少次免疫才行，對豬偽狂犬高免血清的制作是一個(gè)很好的思考，這方面有待進(jìn)一步驗(yàn)證。但至少說明，仔豬只進(jìn)行1次免疫，其效果很不理想，平均抗體效價(jià)水平較低，起不到保護(hù)作用，所以必須進(jìn)行加強(qiáng)免疫，達(dá)到免疫保護(hù)目的。

由于免疫時(shí)間組和免疫劑量組的試驗(yàn)是分開來做的，而且是不同窩的仔豬，并不能很明確地說明本次試驗(yàn)的最佳免疫劑量程序和最佳免疫時(shí)間程序的簡單疊加就是最好的免疫程序，但為以后的相關(guān)研究提供了一個(gè)很好的基礎(chǔ)。

豬偽狂犬疫苗有弱毒苗、滅活苗、基因缺失疫苗、亞單位疫苗等多種類型，而本次試驗(yàn)采用的是豬偽狂犬病活疫苗，究竟哪種類型的疫苗進(jìn)行免疫后能得到更高的抗體水平，本試驗(yàn)沒有研究，但這也是制作高免血清和提升臨床免疫抗體效價(jià)的一個(gè)重要影響因素。由于本次采用的是豬偽狂犬病毒膠乳凝集試驗(yàn)檢測試劑盒進(jìn)行抗體檢測，判定結(jié)果時(shí)不一定十分精確，而且究竟什么樣的抗體水平才達(dá)到了高免血清的用血要求，并沒有具體參考文獻(xiàn)，只是表明本次試驗(yàn)的部分試驗(yàn)豬抗體效價(jià)較高，有待采用ELISA檢測方法檢測，并參考相關(guān)資料文獻(xiàn)和具體試驗(yàn)，判定是否為合格的臨床使用高免血清。

參考文獻(xiàn)：

[1]蔡寶祥. 家畜傳染病學(xué)[M]. 4版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：207-209.

[2]趙東升，劉有昌，安福生. 近年來我國豬偽狂犬病的流行狀況和分析[J]. 今日養(yǎng)豬業(yè)，2008（6）：26-28.

[3]蘆惟本，黃川. 進(jìn)口偽狂犬弱毒疫苗引發(fā)偽狂犬病流行的報(bào)道[J]. 今日養(yǎng)豬業(yè)，2009（4）：15-16.

[4]曾智勇，湯德元，郭萬柱. 偽狂犬病疫苗的研究[J]. 世界農(nóng)業(yè)，2007（10）：66-69.

[5]孔令達(dá)，符芳，于輝，等. 豬偽狂犬病高免血清的制作與初步應(yīng)用[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，26（5）：359-362.

2.3豬偽狂犬病不同免疫時(shí)間抗體效價(jià)的差異性

免疫時(shí)間組B1與B2、B3差異顯著（P<0.05），B2與B3組差異不顯著，且B2、B3組抗體效價(jià)較高。

2.4對照組和試驗(yàn)組豬偽狂犬病抗體效價(jià)的差異性

采用非配對雙樣本均值分析，試驗(yàn)組與對照組仔豬的抗體效價(jià)差異極顯著（P<0.01）。試驗(yàn)組豬偽狂犬病毒的抗體效價(jià)明顯高于未免疫的對照組。

3討論

供試仔豬因母豬和仔豬均未注射過豬偽狂犬疫苗，且最近并未發(fā)生過豬偽狂犬病，在檢測中也未檢測出豬偽狂犬病毒抗體效價(jià)，表明供試豬無母源抗體影響，適用于本試驗(yàn)要求；在免疫后，除對照組外，其余試驗(yàn)豬抗體效價(jià)均有不同程度的升高，表明所作免疫是成功的。

在免疫劑量3個(gè)處理組中，A1組的4頭試驗(yàn)仔豬的抗體效價(jià)均達(dá)到了1 ∶64以上的水平，表現(xiàn)出了較高的抗體水平，而A2、A3組的試驗(yàn)豬抗體效價(jià)雖比免疫前有了較大提高，但與A1組相比至少低1個(gè)梯度。因A1組試驗(yàn)豬在最后一次免疫時(shí)劑量加倍，且在1周后就采血，是否說明經(jīng)多次免疫后，在最后一次免疫加大劑量對抗體效價(jià)提升有很大影響將進(jìn)一步驗(yàn)證。

在免疫時(shí)間組的3個(gè)處理中，B2、B3組的試驗(yàn)豬抗體水平均較B1組高，說明本次試驗(yàn)B2、B3組的免疫程序效果較好。

試驗(yàn)仔豬在免疫后與免疫前，無論是免疫劑量組還是免疫時(shí)間組其豬偽狂犬病毒的抗體水平差異極顯著，但是免疫劑量組抗體平均水平與免疫時(shí)間組抗體水平相比，免疫劑量組抗體水平明顯高于免疫時(shí)間組的平均水平。因免疫劑量組做了3次免疫，而免疫時(shí)間組只做了2次免疫，這是否說明免疫次數(shù)增多會(huì)提高抗體效價(jià)，或者制作高免血清至少要進(jìn)行多少次免疫才行，對豬偽狂犬高免血清的制作是一個(gè)很好的思考，這方面有待進(jìn)一步驗(yàn)證。但至少說明，仔豬只進(jìn)行1次免疫，其效果很不理想，平均抗體效價(jià)水平較低，起不到保護(hù)作用，所以必須進(jìn)行加強(qiáng)免疫，達(dá)到免疫保護(hù)目的。

由于免疫時(shí)間組和免疫劑量組的試驗(yàn)是分開來做的，而且是不同窩的仔豬，并不能很明確地說明本次試驗(yàn)的最佳免疫劑量程序和最佳免疫時(shí)間程序的簡單疊加就是最好的免疫程序，但為以后的相關(guān)研究提供了一個(gè)很好的基礎(chǔ)。

豬偽狂犬疫苗有弱毒苗、滅活苗、基因缺失疫苗、亞單位疫苗等多種類型，而本次試驗(yàn)采用的是豬偽狂犬病活疫苗，究竟哪種類型的疫苗進(jìn)行免疫后能得到更高的抗體水平，本試驗(yàn)沒有研究，但這也是制作高免血清和提升臨床免疫抗體效價(jià)的一個(gè)重要影響因素。由于本次采用的是豬偽狂犬病毒膠乳凝集試驗(yàn)檢測試劑盒進(jìn)行抗體檢測，判定結(jié)果時(shí)不一定十分精確，而且究竟什么樣的抗體水平才達(dá)到了高免血清的用血要求，并沒有具體參考文獻(xiàn)，只是表明本次試驗(yàn)的部分試驗(yàn)豬抗體效價(jià)較高，有待采用ELISA檢測方法檢測，并參考相關(guān)資料文獻(xiàn)和具體試驗(yàn)，判定是否為合格的臨床使用高免血清。

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[3]蘆惟本，黃川. 進(jìn)口偽狂犬弱毒疫苗引發(fā)偽狂犬病流行的報(bào)道[J]. 今日養(yǎng)豬業(yè)，2009（4）：15-16.

[4]曾智勇，湯德元，郭萬柱. 偽狂犬病疫苗的研究[J]. 世界農(nóng)業(yè)，2007（10）：66-69.

[5]孔令達(dá)，符芳，于輝，等. 豬偽狂犬病高免血清的制作與初步應(yīng)用[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，26（5）：359-362.

2.3豬偽狂犬病不同免疫時(shí)間抗體效價(jià)的差異性

免疫時(shí)間組B1與B2、B3差異顯著（P<0.05），B2與B3組差異不顯著，且B2、B3組抗體效價(jià)較高。

2.4對照組和試驗(yàn)組豬偽狂犬病抗體效價(jià)的差異性

采用非配對雙樣本均值分析，試驗(yàn)組與對照組仔豬的抗體效價(jià)差異極顯著（P<0.01）。試驗(yàn)組豬偽狂犬病毒的抗體效價(jià)明顯高于未免疫的對照組。

3討論

供試仔豬因母豬和仔豬均未注射過豬偽狂犬疫苗，且最近并未發(fā)生過豬偽狂犬病，在檢測中也未檢測出豬偽狂犬病毒抗體效價(jià)，表明供試豬無母源抗體影響，適用于本試驗(yàn)要求；在免疫后，除對照組外，其余試驗(yàn)豬抗體效價(jià)均有不同程度的升高，表明所作免疫是成功的。

在免疫劑量3個(gè)處理組中，A1組的4頭試驗(yàn)仔豬的抗體效價(jià)均達(dá)到了1 ∶64以上的水平，表現(xiàn)出了較高的抗體水平，而A2、A3組的試驗(yàn)豬抗體效價(jià)雖比免疫前有了較大提高，但與A1組相比至少低1個(gè)梯度。因A1組試驗(yàn)豬在最后一次免疫時(shí)劑量加倍，且在1周后就采血，是否說明經(jīng)多次免疫后，在最后一次免疫加大劑量對抗體效價(jià)提升有很大影響將進(jìn)一步驗(yàn)證。

在免疫時(shí)間組的3個(gè)處理中，B2、B3組的試驗(yàn)豬抗體水平均較B1組高，說明本次試驗(yàn)B2、B3組的免疫程序效果較好。

試驗(yàn)仔豬在免疫后與免疫前，無論是免疫劑量組還是免疫時(shí)間組其豬偽狂犬病毒的抗體水平差異極顯著，但是免疫劑量組抗體平均水平與免疫時(shí)間組抗體水平相比，免疫劑量組抗體水平明顯高于免疫時(shí)間組的平均水平。因免疫劑量組做了3次免疫，而免疫時(shí)間組只做了2次免疫，這是否說明免疫次數(shù)增多會(huì)提高抗體效價(jià)，或者制作高免血清至少要進(jìn)行多少次免疫才行，對豬偽狂犬高免血清的制作是一個(gè)很好的思考，這方面有待進(jìn)一步驗(yàn)證。但至少說明，仔豬只進(jìn)行1次免疫，其效果很不理想，平均抗體效價(jià)水平較低，起不到保護(hù)作用，所以必須進(jìn)行加強(qiáng)免疫，達(dá)到免疫保護(hù)目的。

由于免疫時(shí)間組和免疫劑量組的試驗(yàn)是分開來做的，而且是不同窩的仔豬，并不能很明確地說明本次試驗(yàn)的最佳免疫劑量程序和最佳免疫時(shí)間程序的簡單疊加就是最好的免疫程序，但為以后的相關(guān)研究提供了一個(gè)很好的基礎(chǔ)。

豬偽狂犬疫苗有弱毒苗、滅活苗、基因缺失疫苗、亞單位疫苗等多種類型，而本次試驗(yàn)采用的是豬偽狂犬病活疫苗，究竟哪種類型的疫苗進(jìn)行免疫后能得到更高的抗體水平，本試驗(yàn)沒有研究，但這也是制作高免血清和提升臨床免疫抗體效價(jià)的一個(gè)重要影響因素。由于本次采用的是豬偽狂犬病毒膠乳凝集試驗(yàn)檢測試劑盒進(jìn)行抗體檢測，判定結(jié)果時(shí)不一定十分精確，而且究竟什么樣的抗體水平才達(dá)到了高免血清的用血要求，并沒有具體參考文獻(xiàn)，只是表明本次試驗(yàn)的部分試驗(yàn)豬抗體效價(jià)較高，有待采用ELISA檢測方法檢測，并參考相關(guān)資料文獻(xiàn)和具體試驗(yàn)，判定是否為合格的臨床使用高免血清。

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[4]曾智勇，湯德元，郭萬柱. 偽狂犬病疫苗的研究[J]. 世界農(nóng)業(yè)，2007（10）：66-69.

[5]孔令達(dá)，符芳，于輝，等. 豬偽狂犬病高免血清的制作與初步應(yīng)用[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，26（5）：359-362.