松花菜對銅脅迫的響應及外源水楊酸和赤霉素對銅毒害的緩解效應

彭海濤++陳煒煬++姜永平

摘要：為了研究銅脅迫對松花菜的毒害以及水楊酸和赤霉素對銅毒害的緩解效應，通過水培試驗，用0.01、0.05、0.25、0.50 mmol/L的銅處理松花菜幼苗，并用不同濃度的水楊酸和赤霉素誘導0.50 mmol/L銅脅迫的幼苗，測定葉綠素、可溶性蛋白、可溶性糖、有機酸、硝酸鹽等生理指標。結果表明，銅脅迫可引起這些生理指標的變化，對松花菜幼苗產生不同的毒害效應，水楊酸和赤霉素能夠不同程度地緩解銅的毒害。

關鍵詞：松花菜；銅脅迫；水楊酸；赤霉素；生理指標

中圖分類號： Q945.78文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0149-04

收稿日期：2013-12-27

作者簡介：彭海濤（1984—），男，河南濮陽人，博士，中級農藝師，研究方向為蔬菜遺傳育種與分子生物學。E-mail：penght2012@163.com。銅是高等植物生長發(fā)育過程中必需的一種微量元素，在植物生命活動中起著重要的作用。但是在蔬菜種植過程中，大量的銅存在會對植株造成毒害，不但阻礙植株的生長，影響蔬菜的產量和品質，更為嚴重的是通過食物鏈危害人類健康。

目前，在一些蔬菜作物上已經進行了銅對植物毒害的研究。銅脅迫不僅能影響小白菜的硝酸鹽、可溶性糖、可溶性蛋白、維生素C等品質指標[1]，以及葉綠素、根系活力、抗逆相關因子（SOD、POD、CAT）等生理指標[2]，而且能夠破壞葉肉細胞的超微結構[3]，從而對植物產生危害。另外，銅脅迫對番茄[4]、黃瓜[5]、蘿卜[6]、甘藍[7]、芥菜[8]等蔬菜作物的生長發(fā)育也具有一定的影響，嚴重影響了蔬菜生產。外源激素在增強植物的抗逆性過程中發(fā)揮著重要作用。水楊酸能夠緩解鹽脅迫對白菜[9]、黃瓜[10]、萵苣[11]、番茄[12]等蔬菜的種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，赤霉素對鹽脅迫下的番茄種子萌發(fā)和幼苗生長也具有緩解效應[13]。

松花菜是花椰菜中的一種，近年來在長江地區(qū)迅速推廣。有關重金屬對松花菜的毒害效應研究較少，銅對松花菜的毒害研究尚未見報道。本試驗研究了重金屬銅脅迫對松花菜幼苗的葉綠素、可溶性蛋白、可溶性糖、有機酸、硝酸鹽等生理指標的影響，以及外源水楊酸和赤霉素對銅毒害的緩解效應，研究結果具有一定的理論和實踐意義。

1材料與方法

1.1試驗材料

松花菜種子雪麗購自浙江神良種業(yè)有限公司。將種子在凈水中浸泡4 h，然后用55 ℃溫水浸種15 min，再置于25 ℃的培養(yǎng)箱中催芽24 h，萌發(fā)的種子播種于裝有相同基質的穴盤中。

1.2銅脅迫處理

待幼苗長至4葉真葉期，從穴盤中取出，用清水小心沖洗干凈根部泥土，用1/2 Hoagland 完全營養(yǎng)液進行水培，培養(yǎng) 3 d 后，在營養(yǎng)液中分別加入不同濃度的銅SO4進行處理，使得營養(yǎng)液中銅的濃度分別為0.01、0.05、0.25、0.50 mmol/L，以不加入銅的處理作為對照（CK）。所有處理均在相同的環(huán)境條件下進行，每個處理設3個生物重復。處理5 d后，進行拍照和生理指標測定。

1.3水楊酸和赤霉素誘導銅脅迫下的松花菜生理指標

在0.5 mmol/L 銅處理的幼苗營養(yǎng)液中，分別加入水楊酸（01、0.5、1.0、2.0、3.0 mmol/L）和赤霉素（50、100、150 mmol/L）。所有處理均在相同的環(huán)境條件下進行，每個處理設3個生物重復。處理5 d后，進行生理指標測定。

1.4測定方法

采用丙酮乙醇混合液法測定葉綠素含量，考馬斯亮藍 G-250 染色法測定可溶性蛋白，蒽酮比色法測定可溶性糖，酸堿滴定法測定有機酸，紫外分光光度法測定硝酸鹽含量。

2結果與分析

2.1銅脅迫對松花菜表型的影響

在脅迫處理5 d后，0.25 mmol/L 銅處理的松花菜葉片開始表現出明顯的毒害癥狀，葉片變薄、失水、失綠，并有灰色圓斑，0.50 mmol/L 銅處理的松花菜受到的毒害更加嚴重，而001 mmol/L和0.05 mmol/L 銅處理的松花菜幾乎沒有毒害癥狀（圖1），表明松花菜對銅的富集效應閾值在0.05～025 mmol/L 之間。

2.2銅脅迫對松花菜生理指標的影響

從銅處理后松花菜葉片的表型來看，葉片變薄、失綠，表明葉綠素的含量明顯減少（圖1）。測定的葉綠素含量變化趨勢和葉片表型完全一致，在0.25、0.50 mmol/L 銅處理下，葉綠素含量顯著降低（圖2-A）。

和對照相比，低濃度銅處理幾乎不影響可溶性蛋白的含量，當濃度升高到0.50 mmol/L時，可溶性蛋白含量明顯增加（圖2-B），這與鎘、鋅脅迫處理的小白菜中可溶性蛋白含量的變化趨勢相同[1，14]。植物體內可溶性蛋白質含量的提高可以降低細胞滲透勢，增加功能蛋白數量，有助于維持細胞正常代謝，從而提高植物抗逆性。結合銅脅迫下松花菜的表型變化，0.50 mmol/L 銅處理時可溶性蛋白含量的增加，可能是由于高濃度銅的毒害作用較強，嚴重影響到植物的生理代謝，植物自身的防御機制需要通過增加功能蛋白數量來增強抗逆性。

銅脅迫對松花菜中可溶性糖含量的影響呈現“低濃度促進、高濃度抑制”的趨勢，0.01 mmol/L 銅處理促進了可溶性糖含量的增加，隨著濃度的增加，銅對可溶性糖積累的促進作用消失（圖2-C）?？扇苄蕴鞘侵参矬w內的一種主要的滲透調節(jié)物質，在低脅迫條件下滲透調節(jié)物質含量增加，可以提高細胞液濃度，降低滲透勢，是一種對外界脅迫的適應性調節(jié)。而高脅迫條件下可溶性糖含量減少，可能是由于高濃度銅 抑制了松花菜的生長，葉綠素減少，光合能力下降，光合產物減少，導致可溶性糖含量減少。從銅脅迫下葉片表型和葉綠素含量變化也可推斷可溶性糖含量的變化。

有機酸是蔬菜品質的重要指標。0.05 mmol/L 銅處理下，有機酸含量減少，可能是由于低濃度銅的毒害作用減弱了植株的代謝活動，導致有機酸含量下降；而在高濃度（0.50 mmol/L） 銅脅迫下，生成了大量有機酸（圖2-D）。據研究，植物在受到重金屬脅迫時，自身會生成大量有機酸來增強抗逆性[15]，0.50 mmol/L 銅脅迫下有機酸含量的增加，可能是植物體生成有機酸來緩解銅的毒害。

和對照相比，銅處理抑制了植物體內硝酸鹽的積累，而不同濃度處理下硝酸鹽含量變化不明顯（圖2-E）。硝酸鹽為植物體生命活動提供氮源，可能是銅脅迫抑制了植物體的生命活動，同時減少了硝酸鹽的積累。

2.3外源水楊酸和赤霉素對銅脅迫下松花菜生理指標的影響

水楊酸和赤霉素在植物的抗逆性中發(fā)揮重要作用，并且從表型來看，0.5 mmol/L 銅處理對松花菜產生了較強的毒害性，因此，選擇研究外源水楊酸和赤霉素對0.5 mmol/L 銅脅迫下松花菜的影響。銅處理降低了葉片中葉綠素的含量，加入水楊酸或赤霉素均不能緩解銅的毒害作用，反而由于激素濃度的增加到一定程度，葉綠素含量有減少的趨勢（圖3-A）。這與水楊酸對小白菜抗鉛脅迫的誘導研究結果相同，即1.5 mmol/L 水楊酸不能緩解0.3 mmol/L 鉛脅迫對小白菜幼苗的毒害，反而更加減少了葉綠素含量[16]，表明銅對松花菜的毒害具有劑量效應，一旦銅的濃度高于閥值，對葉綠素的毒害將不可逆轉，加入的水楊酸和赤霉素起到了加重毒害的作用。

水楊酸和赤霉素誘導銅脅迫下松花菜可溶性蛋白含量的變化趨勢相同（圖3-B），即隨著水楊酸和赤霉素濃度的增

大，可溶性蛋白含量呈先減少后增加趨勢?？赡苁怯捎诟邼舛燃に嘏c銅形成的復合傷害有關。對其他一些蔬菜作物如小白菜[16]、黃瓜[17]、菜豆[18]等的研究中，也有類似的結論。

可溶性糖是植物體內的能量物質，主要由光合作用合成。水楊酸和赤霉素誘導并不能增加葉片內葉綠素的含量（圖 3-A），卻能夠在一定范圍內增加可溶性糖的含量（圖 3-C），表明水楊酸和赤霉素誘導可增強其他糖代謝途徑，同時也表明抗逆性的增強。

低濃度水楊酸處理能夠使有機酸含量降低，處于和對照相同的水平，可能是水楊酸誘導緩解了銅的毒害作用；而高濃度水楊酸誘導下，有機酸含量水平與僅用0.5 mmol/L 銅脅迫下的水平相同，表明高濃度水楊酸可能對植株形成了毒害作用，導致植株生成有機酸來增強抗逆性。赤霉素的誘導作用與低濃度水楊酸誘導作用相同（圖3-D）。

水楊酸誘導對硝酸鹽含量的變化無明顯作用，而赤霉素誘導下硝酸鹽含量高于對照（圖3-E），表明赤霉素能夠誘導植物體內硝酸鹽的生成。有研究表明，外源赤霉素能夠抑制硝酸鹽的生成[19]，與本試驗結論相反，表明本試驗中赤霉素與銅可能形成了復合型產物毒害植株，導致硝酸鹽含量升高。

3討論與結論

有研究表明，當土壤中重金屬濃度超過植物富集所能達到的臨界值，甚至高出幾倍的情況下，植物表現出明顯的重金屬毒害癥狀；當重金屬濃度低于植物富集所能達到的臨界值時，受重金屬脅迫的植物表現出與普通植物相同的特征[20]。本試驗中，當銅 的濃度達到0.25 mmol/L以上時，松花菜才表現出明顯的毒害癥狀（圖1），表明0.25 mmol/L 銅超過了松花菜對銅的富集能力，富集閾值在0.05～0.25 mmol/L之間，銅脅迫對松花菜的毒害具有劑量效應。

銅脅迫導致松花菜葉片變黃（圖1），表明銅促使葉綠素降解，葉綠素含量的測定結果也證明了這一結論（圖2-A），外源水楊酸或赤霉素不能緩解銅對葉綠素的毒害效應（圖3-A）。然而，水楊酸和赤霉素能誘導銅脅迫下可溶性糖含量增加（圖3-C），表明它們可能是通過激發(fā)其他的糖代謝途徑來促進糖的積累，而不是通過葉綠體的光合作用來實現的。

銅脅迫能夠激發(fā)松花菜葉片中可溶性蛋白含量的增加（圖2-B），可能是通過降低細胞滲透勢和增加功能蛋白數量來增強植株的抗逆性。在一定范圍內，低濃度水楊酸或赤霉素能夠減少可溶性蛋白的含量，高濃度則促進可溶性蛋白含量的增加（圖3-B），可能是由于低濃度激素處理減緩了銅的毒害效應，而高濃度激素本身具有毒害作用，通過促進可溶性蛋白的增加來增強抗逆性。植物體內的有機酸能夠通過螯合作用與重金屬形成螯合物，從而減緩重金屬對植物的影響[21]。在低濃度（0.05 mmol/L）銅脅迫下，有機酸與銅形成了螯合物，導致有機酸的含量低于對照；隨著銅濃度的增加，植物需要產生大量的有機酸來螯合銅，從而增強抗逆性。低濃度的水楊酸和赤霉素能夠緩解銅的毒害，從而使有機酸含量降低（圖3-D）。銅脅迫能夠抑制植物體內硝酸鹽的生成（圖2-E），而激素處理反而會在一定范圍內增加硝酸鹽含量（圖3-E），表明激素處理緩解了銅的毒害效應。由于硝酸鹽能夠危害人體健康，因此生產中通過施用水楊酸或赤霉素來緩解銅的毒害時，需要控制最適施用量。

總之，重金屬銅脅迫能夠對松花菜的葉綠素、可溶性蛋白、可溶性糖、有機酸和硝酸鹽等生理指標產生影響，對植株產生毒害作用，通過外施一定濃度的水楊酸或赤霉素能夠緩解銅的毒害。在外施水楊酸或赤霉素的過程中，需要通過試驗來確定最適的激素濃度，否則有可能加重毒害或者起不到緩解毒害的效果。

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