雞α干擾素在巴斯德畢赤酵母中的分泌表達及抗病毒功能初探

韋琴等

摘要：為了研究雞α干擾素（ChIFNα）基因的特性和功能，將雞α干擾素的DNA序列克隆到巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）分泌表達載體pPIC9K中，并轉化入巴斯德畢赤酵母GS115菌株，用PCR技術鑒定陽性轉化子。重組菌株GS115/pPIC9K-IFNα用1%甲醇誘導后，分泌表達重組蛋白，斑點雜交（dot-blot）檢測IFNα具有免疫原性。細胞病變抑制法表明，表達產(chǎn)物有明顯的抗雞H9N2亞型禽流感病毒活性。

關鍵詞：雞α干擾素；巴斯德畢赤酵母；免疫原性；細胞病變抑制法

中圖分類號： S852.65+7文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0049-03

收稿日期：2013-12-24

作者簡介：韋琴（1981—），女，湖北天門人，碩士，講師，主要從事生物化學與分子生物學方向的研究。E-mail：53471348@qq.com。干擾素（interferon，IFN）是一類具有廣譜抗病毒活性的細胞因子，能調(diào)節(jié)機體免疫反應[1]。α干擾素是由能在脊椎動物各種類型的細胞中增殖的病毒誘導白細胞產(chǎn)生的[2]，其主要活性是抗病毒。Sekellick等于1994年克隆表達了雞的α干擾素 （ChIFNα）基因[3]，其后的文獻也報道了紅色原雞中命名為IFNA1、IFNA2和IFNA3的干擾素基因序列[4-5]。到目前為止，已知ChIFNα的抗病毒能力較強，比ChIFNβ強20倍左右。對于巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）的研究起始于1970年左右。巴斯德畢赤酵母是甲醇營養(yǎng)型酵母中的一類能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源，大量合成外源蛋白質的酵母菌，因此，該酵母引起了人們的興趣和關注，得到了廣泛的研究和應用。目前有關細胞因子在巴斯德畢赤酵母中獲得表達的報道屢見不鮮[6-9]。

我國養(yǎng)禽業(yè)經(jīng)過近30年的持續(xù)穩(wěn)步增長，已成為世界上最大的養(yǎng)禽國之一。禽病大規(guī)模暴發(fā)會給我國養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，因此，利用干擾素基因結合基因工程手段生產(chǎn)生物制劑，來預防和治療禽類的各種病毒傳染病具有重要意義。本研究以質粒pPIC9K為骨架，成功構建了巴斯德畢赤酵母表達載體pPIC9K-IFNα，在巴斯德畢赤酵母菌GS115中獲得了分泌表達的重組干擾素，并進一步探討了其抗病毒活性。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1質粒和菌株pET28a-IFNα質粒：大小約489 bp的去信號肽ChIFNα基因序列，由華中農(nóng)業(yè)大學微生物國家重點實驗室構建[10]。酵母表達載體及酵母受體菌GS115購自Invitrogen公司。

1.1.2試劑和培養(yǎng)基常用工具酶、DNA marker均購自TaKaRa公司；酵母氨基（yeast nitrogen base withour amino acids，YNB）、生物素購自Pifco公司。

1.1.3血清和酶標抗體辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗兔IgG二抗購自華美公司；兔抗雞α干擾素多抗由華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室制備和提供。

1.1.4雞胚和病毒雞H9N2亞型禽流感病毒由華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室提供，SPF（specific pathogen free）雞胚購自北京梅里亞維通實驗中心。

1.2重組質粒pPIC9K-IFNα的構建

pET28a-IFNα經(jīng)EcoRⅠ與NotⅠ雙酶切，用T4 DNA連接酶將回收產(chǎn)物IFNα基因片斷與經(jīng)相同酶切的pPIC9K質粒連接，并轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，平板涂布后挑取單菌落。提取的重組質粒pPIC9K-IFNα由酶切鑒定。

1.3重組質粒pPIC9K-IFNα的轉化及鑒定

1.3.1pPIC9K-IFNα的轉化將提純的pPIC9K-IFNα質粒用SalⅠ酶切線性化，電泳回收后置于-20 ℃?zhèn)溆?。?0.1 mol/L 的LiCl制備GS115酵母感受態(tài)。將線性化的表達質粒在LiCl、50% PEG與2 mg/mL ssDNA的輔助下轉化至GS115酵母感受態(tài)細胞中，涂布于MD（minimal dextrose）固體平皿上，置28 ℃溫箱培養(yǎng)3～4 d。

1.5重組雞α干擾素抗病毒活性的初步檢測

用細胞病變抑制法探討重組干擾素抗病毒的能力[12-16]：雞胚成纖維細胞于96孔滅菌細胞培養(yǎng)板中，飽和二氧化碳水汽培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)，長成單層。每列各100 μL/孔加入10倍系列稀釋的干擾素表達產(chǎn)物，同時設細胞空白對照（只加維持液，不加病毒和干擾素）和病毒對照（只加病毒，不加干擾素）；1 d后，每孔加入稀釋的H9N2禽流感病毒（100倍TCID50溶液濃度）。1 d后，開始觀察細胞病變。

2結果與分析

2.1重組質粒pPIC9K-IFNα的構建

回收產(chǎn)物IFNα基因片段與pPIC9K載體連接后，轉化DH5α，挑白色菌落，小量提取重組質粒，用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶消化，得到500 bp的小片段和9 kb的大片段，2個條帶與預期結果一致（圖1）。表明目的片段已成功克隆到載體中，命名為pPIC9K-IFNα。

2.2重組酵母染色體陽性克隆子pPIC9K-IFNα的PCR鑒定

隨機挑取在MD平皿中的GS115/pPIC9K-IFNα酵母單菌落，經(jīng)酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)至對數(shù)生長期，提取酵母DNA作為模板進行PCR檢測。分別以2對引物作2組PCR鑒定（圖2）。結果表明，2對引物均擴增出1條特異性很高的目的片段，長度分別是500 bp和695 bp，與預期片段大小相符，表明重組質粒pPIC9K-IFNα已成功整合到GS115 菌株染色體中。

2.3重組酵母菌的表達和dot-blot分析

經(jīng)dot-blot分析確證，重組酵母菌誘導表達的上清液檢測出顏色較深的斑點，而空白菌沒有（圖3）。結果表明，GS115/pPIC9KIFNα表達產(chǎn)物具有良好的免疫原性。

2.4重組雞α干擾素表達產(chǎn)物抗病毒活性初步檢測

在雞胚成纖維細胞上分析重組干擾素表達產(chǎn)物抗病毒的能力。結果顯示，空白對照孔細胞生長良好，陽性對照孔細胞皺褶，病變嚴重（90%病變）；加入102、103、104倍稀釋后的表達產(chǎn)物的細胞孔中細胞生長狀態(tài)與空白對照孔一致，基本無病變；表達產(chǎn)物105倍稀釋后，所加的細胞孔中細胞生長狀態(tài)仍然良好，有15%的病變，表明105倍稀釋后的干擾素依然有抗病毒的活性；106倍稀釋后所加的細胞孔中細胞有40%病變，107、108倍稀釋后所加的細胞孔中細胞發(fā)生90%的病變（圖4）。以上結果表明重組雞α干擾素能夠抑制H9N2禽流感病毒的復制。

3討論與結論

巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)是近十年發(fā)展起來的具有高效分泌表達的一種真核表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)能進行真核轉錄后修飾，如糖基化、二硫鍵的形成和蛋白水解處理，在表達產(chǎn)物的加工、外分泌等方面優(yōu)勢明顯[17]。本研究選用的載體pPIC9K是一種分泌表達載體，不僅能夠實現(xiàn)翻譯后糖基化修飾和正確折疊，而且有利于表達產(chǎn)物的純化。

在本試驗中，重組菌GS115/pPIC9K-IFNα的誘導上清經(jīng)dot-blot分析，發(fā)現(xiàn)其能分泌表達出IFNα，證實重組蛋白IFNα分泌到巴斯德畢赤酵母細胞外，且有一定的抗雞H9N2亞型禽流感病毒的活性。本試驗為重組雞干擾素作為疫苗佐劑的研究和推廣應用打下基礎。

參考文獻：

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[16]費崢崢，關怡新，姚善涇. 重組人γ干擾素復性過程中體外活性檢測方法研究[J]. 微生物學通報，2004，31（3）：65-69.

[17]Cereghino J L，Cregg J M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J]. FEMS Microbiology Reviews，2000，24（1）：45-66.

2.3重組酵母菌的表達和dot-blot分析

經(jīng)dot-blot分析確證，重組酵母菌誘導表達的上清液檢測出顏色較深的斑點，而空白菌沒有（圖3）。結果表明，GS115/pPIC9KIFNα表達產(chǎn)物具有良好的免疫原性。

2.4重組雞α干擾素表達產(chǎn)物抗病毒活性初步檢測

在雞胚成纖維細胞上分析重組干擾素表達產(chǎn)物抗病毒的能力。結果顯示，空白對照孔細胞生長良好，陽性對照孔細胞皺褶，病變嚴重（90%病變）；加入102、103、104倍稀釋后的表達產(chǎn)物的細胞孔中細胞生長狀態(tài)與空白對照孔一致，基本無病變；表達產(chǎn)物105倍稀釋后，所加的細胞孔中細胞生長狀態(tài)仍然良好，有15%的病變，表明105倍稀釋后的干擾素依然有抗病毒的活性；106倍稀釋后所加的細胞孔中細胞有40%病變，107、108倍稀釋后所加的細胞孔中細胞發(fā)生90%的病變（圖4）。以上結果表明重組雞α干擾素能夠抑制H9N2禽流感病毒的復制。

3討論與結論

巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)是近十年發(fā)展起來的具有高效分泌表達的一種真核表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)能進行真核轉錄后修飾，如糖基化、二硫鍵的形成和蛋白水解處理，在表達產(chǎn)物的加工、外分泌等方面優(yōu)勢明顯[17]。本研究選用的載體pPIC9K是一種分泌表達載體，不僅能夠實現(xiàn)翻譯后糖基化修飾和正確折疊，而且有利于表達產(chǎn)物的純化。

在本試驗中，重組菌GS115/pPIC9K-IFNα的誘導上清經(jīng)dot-blot分析，發(fā)現(xiàn)其能分泌表達出IFNα，證實重組蛋白IFNα分泌到巴斯德畢赤酵母細胞外，且有一定的抗雞H9N2亞型禽流感病毒的活性。本試驗為重組雞干擾素作為疫苗佐劑的研究和推廣應用打下基礎。

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2.3重組酵母菌的表達和dot-blot分析

經(jīng)dot-blot分析確證，重組酵母菌誘導表達的上清液檢測出顏色較深的斑點，而空白菌沒有（圖3）。結果表明，GS115/pPIC9KIFNα表達產(chǎn)物具有良好的免疫原性。

2.4重組雞α干擾素表達產(chǎn)物抗病毒活性初步檢測

在雞胚成纖維細胞上分析重組干擾素表達產(chǎn)物抗病毒的能力。結果顯示，空白對照孔細胞生長良好，陽性對照孔細胞皺褶，病變嚴重（90%病變）；加入102、103、104倍稀釋后的表達產(chǎn)物的細胞孔中細胞生長狀態(tài)與空白對照孔一致，基本無病變；表達產(chǎn)物105倍稀釋后，所加的細胞孔中細胞生長狀態(tài)仍然良好，有15%的病變，表明105倍稀釋后的干擾素依然有抗病毒的活性；106倍稀釋后所加的細胞孔中細胞有40%病變，107、108倍稀釋后所加的細胞孔中細胞發(fā)生90%的病變（圖4）。以上結果表明重組雞α干擾素能夠抑制H9N2禽流感病毒的復制。

3討論與結論

巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)是近十年發(fā)展起來的具有高效分泌表達的一種真核表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)能進行真核轉錄后修飾，如糖基化、二硫鍵的形成和蛋白水解處理，在表達產(chǎn)物的加工、外分泌等方面優(yōu)勢明顯[17]。本研究選用的載體pPIC9K是一種分泌表達載體，不僅能夠實現(xiàn)翻譯后糖基化修飾和正確折疊，而且有利于表達產(chǎn)物的純化。

在本試驗中，重組菌GS115/pPIC9K-IFNα的誘導上清經(jīng)dot-blot分析，發(fā)現(xiàn)其能分泌表達出IFNα，證實重組蛋白IFNα分泌到巴斯德畢赤酵母細胞外，且有一定的抗雞H9N2亞型禽流感病毒的活性。本試驗為重組雞干擾素作為疫苗佐劑的研究和推廣應用打下基礎。

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[7]Clare J J，Romanos M A，Rayment F B，et al. Production of mouse epidermal growth factor in yeast：high-level secretion using Pichia pastoris strains containing multiple gene copies[J]. Gene，1991，105（2）：205-212.

[8]Hollenberg C P，Gellissen G. Production of recombinant proteins by methylotrophic yeasts[J]. Curr Opin Biotech，1997，8：554-560.

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[11]劉秋云，羅樨，何康澤，等. 快速制備酵母質粒和基因組DNA PCR模板[J]. 微生物學通報，2001，28（5）：77-79，84.

[12]孫為民，王惠琴. 細胞因子研究方法學[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1999：433-458.

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[16]費崢崢，關怡新，姚善涇. 重組人γ干擾素復性過程中體外活性檢測方法研究[J]. 微生物學通報，2004，31（3）：65-69.

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