荷花ISSR引物篩選及反應(yīng)體系優(yōu)化

2014-11-22 12:15:47徐君等

江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年10期

徐君等

摘要：利用加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的100條ISSR引物，以2個(gè)荷花品種的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用單因素試驗(yàn)方法對(duì)荷花ISSR-PCR反應(yīng)體系的5個(gè)因素（Mg2+、引物、dNTP、模板DNA、Taq酶）進(jìn)行濃度優(yōu)化，確定了荷花ISSR反應(yīng)的25 μL最佳擴(kuò)增體系為：10×Taq Buffer 2.5 μL，Mg2+ 3.0 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，引物 1.0 μmol/L，Taq酶 1.00 U，模板DNA 40 ng。篩選出8條擴(kuò)增條帶較好的ISSR引物，并對(duì)其引物進(jìn)行梯度PCR試驗(yàn)，篩選出各引物對(duì)應(yīng)的最佳退火溫度，擴(kuò)增共計(jì)獲得61條ISSR條帶。

關(guān)鍵詞：荷花；ISSR 引物篩選；體系優(yōu)化

中圖分類號(hào)： S682.320.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）10-0042-03

收稿日期：2013-12-09

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（12）5075]。

作者簡介：徐君（1982—），男，江蘇蘇州人，碩士，助理研究員，主要從事植物細(xì)胞工程研究。Tel：（0512）65386213；E-mail：flyforever007@163.com。

通信作者：姜紅衛(wèi)，副研究員，主要從事觀賞園藝研究。Tel：（0512）65389221；E-mail：sacjhw@163.com。荷花（Nelumbo nucifera）是我國的十大名花之一，具有較高的觀賞價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在食用、藥用、園林綠化以及外貿(mào)出口等方面有很大的開發(fā)潛力[1]。我國是荷花的原產(chǎn)地之一，荷花品種資源十分豐富，近年來，育種工作者利用資源優(yōu)勢(shì)，采用自然雜交與人工雜交的方法，育成了大量的荷花新品種。目前，我國記載收編的荷花品種已超過800個(gè)?！吨袊苫ㄐ缕贩N圖志》按照植物二元分類法，以種系、株型、花型、花色為分類標(biāo)準(zhǔn)，將荷花分為3系6群16類48型[2]。由于荷花品種數(shù)量多、種間差異小、親緣關(guān)系較近，單純利用少數(shù)性狀進(jìn)行定性描述很難闡明荷花品種間的親緣關(guān)系[3]。因此，應(yīng)采用表型與多態(tài)性高、穩(wěn)定性佳的分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的方法對(duì)荷花種質(zhì)資源進(jìn)行研究。ISSR技術(shù)在獲得大量位點(diǎn)信息的同時(shí)，兼具操作簡單、快捷、DNA 用量少、技術(shù)要求低、成本低以及引物設(shè)計(jì)無需了解基因組序列等特點(diǎn)，與RFLP、RAPD技術(shù)相比，ISSR技術(shù)的重復(fù)性、穩(wěn)定性較高[4-6]。目前，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析、遺傳作圖、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等領(lǐng)域[7-10]。ISSR技術(shù)也存在缺陷，由于各引物間AT、CG比例差異很大，特異退火溫度各不相同，如未開展預(yù)備試驗(yàn)，將會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成不可預(yù)計(jì)的影響[11]。因此，為獲得清晰、可靠、準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，在開展ISSR試驗(yàn)前，進(jìn)行反應(yīng)體系優(yōu)化十分必要。江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所自2010年開始，對(duì)太湖地區(qū)的荷花資源進(jìn)行收集、保存、種質(zhì)鑒定，并進(jìn)行了大量的相關(guān)育種工作。對(duì)資源進(jìn)行鑒定是資源利用的基礎(chǔ)，應(yīng)當(dāng)采用表型分析結(jié)合分子標(biāo)記分析方法，對(duì)所收集的荷花資源的遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究優(yōu)化荷花ISSR最佳反應(yīng)體系，篩選最佳引物，為保證ISSR擴(kuò)增結(jié)果清晰、可靠、準(zhǔn)確，根據(jù)特定的ISSR引物設(shè)計(jì)最佳退火溫度，旨在為將ISSR技術(shù)應(yīng)用于荷花種質(zhì)資源研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

荷花取自江蘇省蘇州市荷塘月色濕地公園蘇州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院荷花資源保存圃，參試品種包括白千葉、太湖紅蓮2種。DNA Marker、PCR試劑盒等相關(guān)試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司。100條ISSR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2方法

1.2.1荷花取樣及基因組DNA提取2013年6—7月進(jìn)行取樣，盡量采剛長出的幼葉，取樣時(shí)采用0.5 cm打孔器于每葉四周、中部各打1孔，每品種取3葉，直接放入離心管中，置于 -70 ℃ 下備用。采用改良的CTAB法[12-13]提取荷花基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測(cè)DNA質(zhì)量，通過紫外線分光光度計(jì)測(cè)定260、280 nm處的吸光度值，檢測(cè)DNA的質(zhì)量、濃度，提取原液置于-20 ℃保存，將用于PCR反應(yīng)的DNA工作液進(jìn)一步稀釋至100 ng/μL備用。

1.2.2荷花ISSR反應(yīng)體系優(yōu)化選擇預(yù)備試驗(yàn)中擴(kuò)增效果較好的引物807，對(duì)荷花基因組DNA進(jìn)行ISSR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火 45 s，72 ℃ 延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃ 終止反應(yīng)。反應(yīng)總體積為25 μL，10×Taq Buffer 2.5 μL，Mg2+濃度分別設(shè)為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol/L，dNTP濃度分別設(shè)為01、02、0.3、0.4、0.5 mmol/L，引物濃度分別設(shè)為02、04、06、0.8、1.0 μmol/L，Taq酶用量分別設(shè)為0.25、050、075、100、1.25 U，模板DNA濃度分別為20、40、60、80、100 ng，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外光下UV凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，篩選出最佳的反應(yīng)體系。

1.2.3荷花ISSR引物篩選與梯度PCR反應(yīng)程序從100條ISSR引物中篩選出擴(kuò)增結(jié)果較好的8條引物用于PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系參照“1.2.2”節(jié)。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50～60 ℃（2 ℃/梯度，共6個(gè)梯度）退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃ 終止反應(yīng)。電泳及凝膠觀察方法同“1.2.2”節(jié)，篩選出各引物的最佳退火溫度。

2結(jié)果與分析

2.1基因組DNA提取與檢測(cè)

檢測(cè)同一批提取的 DNA 樣品，結(jié)果表明，主帶明亮，略有拖尾現(xiàn)象，說明CTAB DNA快速提取法效果好，但存在少許DNA降解現(xiàn)象（圖1）。

2.2各因素水平對(duì)ISSR擴(kuò)增反應(yīng)的影響

選用白千葉、太湖紅蓮，檢驗(yàn)Mg2+濃度、dNTP濃度、Primer濃度、Taq酶、模板DNA濃度各因素對(duì)ISSR擴(kuò)增反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖2所示。

2.2.1Mg2+濃度對(duì)ISSR-PCR的影響由圖2-a可知，當(dāng)Mg2+濃度超過1.5 mmol/L時(shí)，大部分?jǐn)U增條帶亮度較好，特異性較強(qiáng)；Mg2+濃度較高時(shí)易與dNTP、引物、模板結(jié)合，影響模板與引物的結(jié)合率，產(chǎn)生非特異性，出現(xiàn)彌散的帶。本試驗(yàn)中，當(dāng)Mg2+濃度小于3.5 mmol/L時(shí)，并未出現(xiàn)以上現(xiàn)象；當(dāng)Mg2+濃度為1.5～3.5 mmol/L時(shí)，條帶無顯著差異，清晰明亮，說明以上濃度均適宜荷花ISSR反應(yīng)，在實(shí)際反應(yīng)中Mg2+濃度采用3.0 mmol/L。

2.2.2dNTP 濃度對(duì) ISSR-PCR 的影響dNTP濃度過低會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)率下降，條帶亮度不足。由圖2-b可知，當(dāng)dNTP濃度為0.1 mmol/L時(shí)；條帶很亮；當(dāng)dNTP濃度大于0.2 mmol/L時(shí)，產(chǎn)生了錯(cuò)配現(xiàn)象，形成了2條非特異條帶。綜合考慮各方面因素，實(shí)際反應(yīng)中dNTP濃度采用0.1 mmol/L。

2.2.3引物濃度對(duì) ISSR-PCR 的影響由圖2-c可知，引物濃度過高易形成引物二聚體，影響PCR擴(kuò)增。因此實(shí)際操作中應(yīng)避免選擇過高的引物濃度，綜合考慮各方面因素，實(shí)際反應(yīng)中引物濃度采用1.0 μmol/L。

2.2.4模板 DNA濃度對(duì) ISSR-PCR 的影響由圖2-d可知，模板 DNA濃度對(duì) ISSR-PCR影響不大，當(dāng)模板DNA總量達(dá)100 ng時(shí)，擴(kuò)增條帶偏暗，說明模板DNA濃度過高會(huì)抑制擴(kuò)增結(jié)果，綜合考慮各方面因素，實(shí)際反應(yīng)中采用25 μL反應(yīng)體系加入40 ng模板DNA。

2.2.5Taq酶濃度對(duì) ISSR-PCR 結(jié)果的影響由圖2-e可知，當(dāng)Taq酶用量小于1.0 U時(shí)條帶相對(duì)較暗，當(dāng)用量為 1.25 U 時(shí)條帶開始彌散，因此實(shí)際操作中Taq酶濃度過低或者過高都不可取，實(shí)際反應(yīng)中采用25 μL反應(yīng)體系加入1 U TaqDNA聚合酶。

2.2.6荷花ISSR擴(kuò)增最優(yōu)化體系經(jīng)上述試驗(yàn)，荷花ISSR擴(kuò)增建立25 μL反應(yīng)體系（表1）。

表1荷花ISSR優(yōu)化體系

成分最終濃度/使用量加入量（μL）10×Taq 酶1×2.5 25 mmol/L Mg2+3.0 mmol/L3.0 2 mmol/L dNTP0.2 mmol/L2.5 25 μmol/L Primer1.0 μmol/L1.0 5 U/μL Taq酶1.00 U0.2 25 ng/μL模板DNA40 ng1.0 滅菌 ddH2O14.8

2.3荷花ISSR引物篩選及退火溫度對(duì)各引物擴(kuò)增的影響

2.3.1荷花ISSR引物的篩選結(jié)果選取白千葉、太湖紅蓮2個(gè)荷花品種，以基因組DNA為模板，分別對(duì)加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）所設(shè)計(jì)的100條引物，按照“2.2”所述最佳反應(yīng)條件及體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出37條有條帶的引物。比對(duì)2個(gè)品種的擴(kuò)增結(jié)果，選擇了8個(gè)荷花ISSR擴(kuò)增最佳引物，具體引物編號(hào)及序列如表2所示。

2.3.2退火溫度對(duì)ISSR引物擴(kuò)增的影響8個(gè)ISSR引物用6個(gè)退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，所有引物均出現(xiàn)不同退火溫度擴(kuò)增帶型差異的情況。選擇各引物擴(kuò)增重復(fù)性好、擴(kuò)增條帶清晰的退火溫度為最佳退火溫度，退火溫度與合成報(bào)告單上的Tm趨勢(shì)有關(guān)，但不完全一致。各引物的最佳退火溫度如表2所示，8個(gè)引物共擴(kuò)增出61條條帶（圖3）。

表28個(gè)荷花ISSR引物序列及各引物的最佳退火溫度

引物編號(hào)引物序列

（5′→3′）最佳退火溫度

（℃）ISSR帶數(shù)

（條）807（AG）8T585808（AG）8C589836（AG）8YA6010840（AG）8YT608842（GA）8YG6011845（CT）8RG585846（CA）8RT586848（CA）8RG587

3結(jié)論與討論

ISSR分子標(biāo)記受多種因素的影響，雖然ISSR較RAPD、RFLP等第一代標(biāo)記穩(wěn)定，但是試驗(yàn)的可靠性、穩(wěn)定性仍然與PCR反應(yīng)條件有很大關(guān)系[14-15]。PCR體系中的Taq酶濃度、Mg2+濃度、引物濃度、dNTP濃度、模板DNA濃度均為重要反應(yīng)條件。本試驗(yàn)表明，荷花ISSR反應(yīng)中各試劑在較廣的濃度范圍均可得到較好的擴(kuò)增結(jié)果，荷花ISSR反應(yīng)25 μL擴(kuò)增體系：10×Taq Buffer 2.5μL，Mg2+ 3.0 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，引物1.0 μmol/L，Taq酶 1.0 U，模板DNA 40 ng。本研究篩選了加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的100條引物，從中篩出8條擴(kuò)增出穩(wěn)定、較亮條帶的引物專門用于荷花遺傳多樣性鑒定。本試驗(yàn)顯示，退火溫度是荷花 ISSR 成功與否的決定性因素，退火溫度過低，會(huì)引起錯(cuò)配，產(chǎn)生非特異條帶，嚴(yán)重影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；退火溫度過高，會(huì)干擾模板與引物結(jié)合，降低擴(kuò)增產(chǎn)量，嚴(yán)重影響讀帶。本研究篩選的所有引物均出現(xiàn)退火溫度不同、擴(kuò)增帶型不同的情況，因此，ISSR擴(kuò)增前應(yīng)當(dāng)通過梯度PCR，精確確定所篩選的 ISSR 引物對(duì)應(yīng)于荷花基因組DNA擴(kuò)增的最適退火溫度。本研究篩選的8個(gè)ISSR引物為807、808、836、840、842、845、846、848，結(jié)合優(yōu)化的PCR體系、最佳的特定引物退火溫度，可擴(kuò)增61條ISSR條帶，ISSR擴(kuò)增結(jié)果較好。荷花ISSR-PCR技術(shù)成本低廉、操作簡便、可靠性高，能提供大量遺傳信息，可用于大量鑒定荷花種質(zhì)資源。

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