大鼠脊髓損傷椎管內(nèi)蛛網(wǎng)膜下腔持續(xù)給藥模型的建立＊

劉德華，王建，高志強，鄒連生，張功亮（.贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江西贛州 34000；.江西省贛州市人民醫(yī)院病理科 34000）

脊髓損傷患者常遺留嚴重傷殘，導致日常生活困難，給家庭和社會造成極大負擔，而且發(fā)病率在全球呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。因此，脊髓損傷后的治療研究已成為全球共同關(guān)注的課題。有必要建立一種穩(wěn)定且重復性好、與臨床脊髓損傷類型相似的動物模型，為后期的脊髓損傷治療提供實驗基礎。本實驗利用Allen法制備急性挫傷型動物模型，模擬臨床上外傷所致的脊髓損傷，并在損傷灶安裝蛛網(wǎng)膜下腔持續(xù)給藥裝置，觀察大鼠的行為表現(xiàn)及給藥裝置的效果，為進一步治療研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料選取健康Wistar大鼠30只，清潔級，體質(zhì)量250～316g，平均（280.1±15.17）g，由贛南醫(yī)學院實驗動物中心提供，雌雄不限。動物按體質(zhì)量從小到大編號，按隨機數(shù)字法將這些動物等分為實驗組和對照組。注藥導管取自一次性使用靜脈輸液針（江西洪達），穿刺囊取自一次性使用無菌注射器（1mL，江西三鑫）。

1.2 方法大鼠用0.15%水合氯醛腹腔注射（按300mg／kg計算），麻醉成功后，將大鼠俯臥位固定于手術(shù)臺上。消毒術(shù)區(qū)皮膚，取T8～T12節(jié)段腰背部正中入路，逐層切開皮膚、皮下組織至脊柱，暴露T9～T11節(jié)段，用手外科持針器咬開T9～T11節(jié)段椎板至兩側(cè)關(guān)節(jié)突，充分暴露脊髓。采用Allen重物墜落法，將10g砝碼由25mm 高度沿玻璃管墜落打擊大鼠開放的T10節(jié)段脊髓［1－2］；大鼠出現(xiàn)擺尾反射、雙后肢及軀體回縮撲動后雙后肢癱瘓。顯微鏡下，將大鼠T10節(jié)段脊髓損傷處的硬脊膜及蛛網(wǎng)膜剪開，將導管頭端剪成30°角斜面，10倍顯微鏡下與硬脊膜行端側(cè)吻合（導管與椎管縱軸相一致）。參考杜世偉等［3］的方法，取1 mL 注射器的筒狀橡膠塞（長5.0 mm）作為穿刺囊（經(jīng)實驗其底面可反復穿刺而不出現(xiàn)液體滲漏），將導管末端插入穿刺囊內(nèi)（兩者管徑接合緊密，為防止術(shù)后脫落用醫(yī)用膠水粘合固定），形成一末端保護裝置縫合于背部皮下筋膜上。徹底止血后逐層縫合肌肉、皮膚。對照組同法暴露脊髓，植入注藥裝置，但不損傷脊髓。各組于術(shù)后1h 經(jīng)腹腔給予每千克2萬單位青霉素，每日2次，連續(xù)3d。均自由飲食。每日膀胱區(qū)按壓排尿3次至大鼠反射性膀胱形成。

1.3 截癱動物的飼養(yǎng)及護理截癱大鼠術(shù)后頸部佩戴硬塑料頸套以防自殘，分籠飼養(yǎng)于配有空調(diào)（室溫21～24℃，濕度55%～65%）、環(huán)境安靜的專用飼養(yǎng)室，配備充足的飼料、水分，及時更換墊料，保持籠內(nèi)清潔。每天按時行2次人工排尿，排尿前先清理尿道口，保持外尿道通暢，排尿時手指輕按充盈的膀胱，逐漸加壓，見有尿排出后保持壓力，排出大部分尿液即可（無需完全排盡尿液，以免擠破膀胱）。排尿后可適當擠壓直腸幫助排便；排便排尿后要及時清理，保持大鼠會陰部干燥，被尿液浸濕的肢體用溫肥皂水清洗，吹干；常改變體位，適當牽拉雙下肢，幫助運動。

1.4 大鼠后肢運動功能評分采用后肢運動功能評分法（BBB）［3－4］，將大鼠后肢運動分為22個等級。后肢全癱為0分，完全正常為21分，兩者之間根據(jù)功能分別定為1～20分，其基本內(nèi)容為：關(guān)節(jié)活動的數(shù)目和范圍，負重程度及前后肢協(xié)調(diào)性，前、后爪和尾部的活動情況。BBB評分觀察期4min，動物應盡量保持在活動范圍的中心區(qū)域活動，分別對大鼠術(shù)后24h、3d、1周、2周、4周進行評分。評分采用雙人雙盲法，取兩人評分均值作為每次記錄值。BBB 評分小于或等于7分定義為運動功能嚴重損傷；大于或等于15分定義為運動功能基本恢復：2次BBB評分增長大于或等于5分定義為運動功能恢復顯著。麻醉蘇醒后BBB 評分0分則表明脊髓損傷模型造模成功。

1.5 導管性能檢測在術(shù)后第1、3、7、14、28天分別進行腦脊液置換術(shù)，檢測導管性能。在體外觸摸注射囊位置，用1 mL注射器經(jīng)皮穿刺囊底，有明顯落空感后，抽出0.1 mL 腦脊液檢測腦脊液中葡萄糖水平，隨后注入0.1ml無菌生理鹽水置換，1h后再抽出0.1mL腦脊液檢測腦脊液中葡萄糖水平［5］。抽液及注液均流暢以及兩次抽取液中含有葡萄糖接近腦脊液中水平則證明導管通暢性能正常；如果兩次抽取液葡萄糖水平明顯減少或兩次檢測結(jié)果相差懸殊，說明導管脫落或堵塞。

1.6 統(tǒng)計學處理采取SPSS 12.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析；計量資料以表示，組間比較用t檢驗；以α＝0.05為檢驗水準，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后一般情況觀察30只大鼠均造模成功，脊髓損傷實驗組大鼠麻醉清醒后均表現(xiàn)為雙后肢截癱，損傷平面以下肌張力降低，肌力0級，對針刺亦無反應，并明顯尿潴留。對照組大鼠四肢活動正常。術(shù)后前3d，大鼠活動較少，進食少，體質(zhì)量有所下降，尿潴留現(xiàn)象比較嚴重，常伴有輕微血尿及腹部脹氣，部分大鼠有大便困難伴硬結(jié)。第4天后，飲食逐漸增加，體質(zhì)量增加，部分大鼠恢復自動排便，尿潴留現(xiàn)象有所改善，但仍需擠壓膀胱幫助排尿。經(jīng)過精心護理，所有大鼠均未出現(xiàn)切口感染現(xiàn)象。1只大鼠在術(shù)后2d死亡，2只大鼠表現(xiàn)為痙攣性癱瘓，2只大鼠導管脫落或堵塞（植入裝置穿刺抽取液中葡萄糖含量極低），6只大鼠表現(xiàn)出不同程度的自殘現(xiàn)象。

2.2 BBB運動功能評分及抽取液葡萄糖含量檢測結(jié)果實驗組各時間段BBB評分均明顯低于對照組，比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。實驗組與對照組各時間段抽取液葡萄糖含量檢測結(jié)果，24h為（2.33±0.29）mmol／L、3d為（2.05±0.24）mmol／L、1周為（2.27±0.26）mmol／L、2周為（2.43±0.37）mmol／L、4周為（2.47±0.41）mmol／L。

表1 兩組各時間段BBB運動功能評分比較（，分）

表1 兩組各時間段BBB運動功能評分比較（，分）

3 討論

隨著人類社會現(xiàn)代化的進程，脊髓損傷的發(fā)病率在全球呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢。脊髓損傷者常遺留嚴重傷殘，引起損傷段以下感覺運動功能喪失，出現(xiàn)截癱或四肢癱，導致日常生活困難，給家庭和社會造成極大負擔［6］。因此，脊髓損傷后的康復治療是醫(yī)患雙方迫切需要解決的問題。為尋求治療脊髓損傷的有效方法，需要建立與臨床脊髓損傷類型極為相似的動物模型，評估脊髓損傷嚴重程度及有效治療的方法，為進一步脊髓損傷的治療提供實驗依據(jù)。

脊髓損傷階段性越高，實驗大鼠病死率及并發(fā)癥越高，目前廣泛使用脊髓T8～T12階段為實驗損傷部位，而且胸段脊髓椎板咬處相對方便［1］。因此，本實驗參照Allen重物墜落法制作大鼠T10節(jié)段脊髓損傷模型，總體實驗數(shù)據(jù)比較穩(wěn)定，重復性較高。傷后3d至1周之間BBB評分明顯升高，運動功能恢復顯著，1周后運動功能恢復不明顯，說明大鼠損傷1周內(nèi)有自我修復能力，1周后漸趨穩(wěn)定［7－8］。本研究脊髓損傷模型術(shù)后表現(xiàn)為痙攣性癱瘓2只，2d后死亡1只，說明這種實驗方式仍存在著一定缺陷，比如外力作用時間不恒定、脊髓損傷不對稱、損傷范圍不恒定等。在無脊髓損傷的對照組BBB 評分仍未達到正常，主要原因考慮為：（1）手術(shù)咬除椎板或剪開硬膜時有可能損傷脊髓；（2）植入注藥裝置后，導管對脊髓的影響作用［9］。輕柔細致的顯微手術(shù)操作，以及選取更為柔軟的導管可能會改善實驗結(jié)果，待進一步實驗證實和改進。

檢測植入注藥裝置通暢性，通常是向蛛網(wǎng)膜下腔注射利多卡后觀察大鼠雙下肢麻痹、癱瘓癥狀［10］；以及一定時間內(nèi)能否恢復下肢活動能力，以此判定位于蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)的導管是否通暢，而對于脊髓損傷已經(jīng)有下肢活動障礙的實驗動物顯然是不合適的。本實驗采取檢測注藥裝置球囊內(nèi)液體的含糖量來判斷導管是否與蛛網(wǎng)膜下腔相通，獲得了成功，而且檢測方便可靠。通過此方法判斷2只大鼠導管脫落或堵塞，后經(jīng)解剖證實導管與硬脊膜吻合口撕裂脫落，與蛛網(wǎng)膜下腔不通。

總之，動物模型對促進實驗干預治療的發(fā)展必不可少，并將繼續(xù)在脊髓損傷治療研究中起到十分重要的作用。探索一種全新的、更加合理有效、穩(wěn)定性好、可重復性強、性狀穩(wěn)定、便于護理的脊髓損傷持續(xù)椎管內(nèi)注藥模型，為脊髓損傷的理論研究奠定了基礎。

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