不同酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測系統(tǒng)評價方法探討＊

楊俊鴻，彭楷，劉加偉，駱展鵬，鄒曉萍，王娟娟（重慶市血液中心 400015）

實驗室檢測結(jié)果的質(zhì)量，是保證血液安全的關(guān)鍵，是減少經(jīng)血傳播疾病的直接手段。通過對多套檢測系統(tǒng)評價結(jié)果的分析，查找實驗室存在的各種不穩(wěn)定因素，實現(xiàn)實驗室質(zhì)量全面管理。一個采供血機構(gòu)實驗室內(nèi)常常擁有多套針對同一檢測項目的檢測系統(tǒng)，而室間質(zhì)評往往只要求上報檢測其中一個檢測系統(tǒng)的結(jié)果。因此，實驗室內(nèi)利用室間質(zhì)評標(biāo)本進行內(nèi)部評價是保障不同檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果準(zhǔn)確性和一致性的重要手段。同時，血站實驗室要通過實驗室認(rèn)可，也需要按照能力驗證規(guī)則要求，當(dāng)實驗室采用不同型號設(shè)備、多臺相同設(shè)備和（或）不同方法對于同一項目（或參數(shù)）出具數(shù)據(jù)時，其中應(yīng)至少有一臺設(shè)備或一種方法參加1次能力驗證并在內(nèi)部開展儀器設(shè)備比對或方法比對。

1 資料與方法

1.1 一般資料4NCU／mL丙型肝炎病毒抗體（抗－HCV）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（北京康徹思坦，批號201204001），2013年中國國際輸血感染預(yù)防和控制項目（CITIC）室間質(zhì)評陽性標(biāo)本共15例，2013年衛(wèi)生部臨檢中心室間質(zhì)評陽性標(biāo)本共7例。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 A 系統(tǒng)：Xiril全自動加樣儀、BEP Ⅲ全自動后處理系統(tǒng)；B 系統(tǒng)：20～200μL 移液器、ELX50／12洗板機、37℃孵育箱、ELX808酶標(biāo)儀。

1.2.2 試劑酶聯(lián)免疫法抗－HCV 診斷試劑盒（美國強生，批號EXE228）、蒸餾水。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本處理將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和（或）室間質(zhì)評血清盤標(biāo)本平衡至室溫后，充分混勻樣本。

1.3.2 穩(wěn)定性評價將4NCU／mL 的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與每天檢測的標(biāo)本一同檢測，A、B 系統(tǒng)分別連續(xù)檢測20次，得到每個系統(tǒng)各20個檢測結(jié)果作為穩(wěn)定性評價數(shù)據(jù)。

1.3.3 準(zhǔn)確性和一致性評價將22例陽性標(biāo)本嚴(yán)格按照試劑說明書要求，用A 系統(tǒng)檢測樣本，采用Xiril全自動加樣儀加樣，BEPⅢ全自動后處理系統(tǒng)檢測。同時，將以上樣本采用B系統(tǒng)檢測，采用移液器加樣，37℃孵育箱孵育，ELX50／12洗板機按說明書要求洗板，最后使用ELX808酶標(biāo)儀在490／630 nm 波長下讀板。

1.3.4 檢測系統(tǒng)評價比較方法根據(jù)本試劑組室間質(zhì)評結(jié)果的吸光度／臨界值比值（S／CO值）均值（x）、標(biāo)準(zhǔn)差（SD），以本試劑組S／CO值均值作為參考結(jié)果計算每個樣本A 系統(tǒng)結(jié)果的S／CO值標(biāo)準(zhǔn)差指數(shù)（SDI1），同時計算B 系統(tǒng)檢測結(jié)果S／CO值與參考結(jié)果之間的標(biāo)準(zhǔn)差指數(shù)（SDI2），SDI1和SDI2分別作為A、B系統(tǒng)準(zhǔn)確性的判定參數(shù)；計算實驗室內(nèi)兩套酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果之間的差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義，作為兩系統(tǒng)一致性的判定依據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

1.4.2 采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用配對t檢驗分析實驗室內(nèi)兩套系統(tǒng)檢測結(jié)果之間的差異；以α＝0.05為檢驗水準(zhǔn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定性評價結(jié)果 A、B 檢測系統(tǒng)連續(xù)20次檢測結(jié)果CV值分別為6.5%和5.3%。

表1 兩套檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果

2.3 一致性評價結(jié)果 A、B 兩套檢測系統(tǒng)的檢測結(jié)果（x1、x2）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

實驗室擁有多套相同或不同型號的檢測系統(tǒng)是目前采供血機構(gòu)的需求，并且醫(yī)療機構(gòu)和采供血機構(gòu)采用的ELISA 檢測系統(tǒng)越來越多樣化，自動化程度越來越高。由于不同的系統(tǒng)使用人員、校準(zhǔn)狀態(tài)、日常維護等方面可能存在差異，使得這些檢測系統(tǒng)的檢測結(jié)果的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性和一致性之間存在一定差異，實驗室需要采取一定的措施來保證這些檢測系統(tǒng)之間的差異性降到最低［1］。本文介紹的方法同樣適用于不同自動化程度的方法、儀器以及不同廠家試劑的性能進行對比評價。

穩(wěn)定性評價標(biāo)本可以采用《血站技術(shù)操作規(guī)程》（2012版）推薦的精密度確認(rèn)時所使用的S／CO 為2～4的標(biāo)本，不適宜采用低值的陰性標(biāo)本和高值陽性標(biāo)本，因為此類標(biāo)本距決定水平點即臨界值（cutoff）的分析濃度相距較遠(yuǎn)。可接受標(biāo)準(zhǔn)可采用《血站技術(shù)操作規(guī)程》（2012版）推薦的CV 在15%以內(nèi)［2］。

ELISA 檢測方法雖是定性試驗，但結(jié)果判斷是通過具體S／CO值數(shù)據(jù)來判斷陰陽性，因此，采用標(biāo)準(zhǔn)差指數(shù)判斷檢測系統(tǒng)是否受控是一個比較客觀的參數(shù)。若︱SDI︱≤2提示檢測值在“均值±2SD”以內(nèi)，根據(jù)室間質(zhì)評結(jié)果分析慣例，有80%的標(biāo)本結(jié)果落在此區(qū)間，表明檢測系統(tǒng)受控；若超過20%的標(biāo)本結(jié)果2≤︱SDI︱提示檢測值系統(tǒng)處于預(yù)警狀態(tài)，需要注意查找檢測過程中可能存在的不足；若超過20%的標(biāo)本結(jié)果︱SDI︱≥3則提示檢測結(jié)果超過“均值±3SD”，表明檢測系統(tǒng)已處于失控狀態(tài)［3］。從本例抗－HCV 室間質(zhì)評結(jié)果中可以看出，本實驗室該項目評價結(jié)果比較理想，血清盤22個樣本A 系統(tǒng)結(jié)果S／CO值與參考結(jié)果符合率達(dá)到100%，22個樣本S／CO值與本試劑組均值之間的標(biāo)準(zhǔn)差指數(shù)只有3個標(biāo)本SDI值在2～3之間，其他結(jié)果均小于2；B系統(tǒng)結(jié)果S／CO值與參考結(jié)果符合率達(dá)到100%，22個樣本S／CO值與本試劑組均值之間的標(biāo)準(zhǔn)差指數(shù)均小于2，提示本實驗室兩套檢測系統(tǒng)均處于受控狀態(tài)，準(zhǔn)確性滿足預(yù)期。

將兩套檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果進行比對其意義在于，在某些極端情況下，兩套檢測系統(tǒng)的檢測結(jié)果陰陽性與參考結(jié)果相符，SDI值也都處于受控范圍，但是一套系統(tǒng)結(jié)果偏高接近“均值＋2SD”，另一套系統(tǒng)結(jié)果偏低接近“均值－2SD”，此時兩者之間的差值已較大，如果遇到低值的弱陽性標(biāo)本或高值陰性標(biāo)本兩套系統(tǒng)檢測結(jié)果可能會不一致。低值弱陽性標(biāo)本可能會引起假陰性從而造成漏檢，高值陰性標(biāo)本可能會引起假反應(yīng)性，造成合格血液報廢。本次抗－HCV 室間質(zhì)評結(jié)果表明，兩套ELISA 檢測系統(tǒng)之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示本實驗室兩套檢測系統(tǒng)具有較好的一致性［4］。

雖然ELISA 檢測方法已經(jīng)非常成熟，但是檢測過程中有很多關(guān)鍵控制點需要注意控制，如：標(biāo)本前處理不正確、樣本污染、加樣不準(zhǔn)、不充分洗滌、洗液瓶中有異物、洗板機堵孔、試劑污染、不正確使用波長讀數(shù)、測試過程反應(yīng)孔干燥、檢驗方法學(xué)上的局限性等都是引起檢測不準(zhǔn)的常見原因［5］。這就需要實驗室檢測人員在試驗操作過程中，要嚴(yán)格遵守標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和試劑、儀器說明書要求進行操作。此外方法學(xué)上的缺陷而導(dǎo)致的檢測結(jié)果出現(xiàn)的誤差，需要試劑廠家不斷改進試劑質(zhì)量，實驗室加強每批試劑使用前的質(zhì)量控制［6］。為了做好檢測結(jié)果的全面質(zhì)量控制，要選擇合格的實驗試劑以及靈敏度和特異性都較好的檢測方法，盡可能減少和避免各種不利因素的干擾，以達(dá)到高效、快速、可靠、經(jīng)濟的檢測；加強檢測儀器的管理，定期校準(zhǔn)，并且定時監(jiān)測檢測儀器的穩(wěn)定性；加強實驗人員的業(yè)務(wù)能力，嚴(yán)格地做好實驗室內(nèi)質(zhì)控，才能取得好的實驗室間質(zhì)評成績［7］。利用室間質(zhì)評結(jié)果及時調(diào)整檢測策略，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，保障輸血安全［8］。

綜上所述，本研究中兩套ELASA 檢測系統(tǒng)穩(wěn)定性較好，檢測結(jié)果均處于可受控狀態(tài)，且具有較好的一致性。

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