腹瀉型腸易激綜合征患者結(jié)腸肥大細(xì)胞與癥狀相關(guān)性研究

秦 斌，郭曉燕，董 蕾，戴 菲，趙菊輝，李 路

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，西安 710004;*通訊作者，E-mail:dong556@126.com)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是常見的功能性胃腸疾病之一，表現(xiàn)為腹痛，腹部不適及排便性狀的改變，發(fā)病原因尚不明確。參與IBS發(fā)生的可能病理生理過程包括內(nèi)臟敏感性增高、腦腸軸功能改變、精神心理因素、腸道炎癥等［1］。肥大細(xì)胞作為免疫細(xì)胞貯存和分泌多種生物活性介質(zhì)，包括組胺、5－羥色胺、前列腺素、P物質(zhì)和細(xì)胞因子等，通過調(diào)節(jié)腸黏膜的局部免疫及黏膜通透性參與IBS的發(fā)生［2］。大量研究證實肥大細(xì)胞在IBS患者結(jié)腸黏膜中數(shù)目發(fā)生改變，但結(jié)果不一。多項研究證實在腹瀉型腸易激綜合征(diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，D-IBS)患者腸道中肥大細(xì)胞計數(shù)明顯高于正常人［3，4］，且肥大細(xì)胞脫顆粒產(chǎn)物組胺、白介素等水平增高［5］。但肥大細(xì)胞計數(shù)與臨床癥狀的相關(guān)性尚無統(tǒng)一結(jié)論。因此本實驗通過研究肥大細(xì)胞與IBS臨床癥狀的相關(guān)性以探討肥大細(xì)胞的可能作用。

1 資料與方法

1.1 對象與材料

根據(jù)功能性胃腸疾病羅馬Ⅲ診斷標(biāo)準(zhǔn)選取2011－10～2013－12西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科門診腹瀉型IBS患者34例，健康對照15例。納入標(biāo)準(zhǔn):無消化道癥狀及體征;既往有結(jié)腸息肉內(nèi)鏡切除史或結(jié)直腸癌家族史;要求行結(jié)腸鏡檢查。排除標(biāo)準(zhǔn):過敏性疾病(哮喘，過敏性紫癜等);近期腸道感染病史或其他部位感染病史;嚴(yán)重系統(tǒng)疾病;2周內(nèi)有服藥史。

PENTAX電子腸鏡由西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科提供;人肥大細(xì)胞類胰蛋白酶(MCT)抗體購自Abcam公司，TRITC標(biāo)記的熒光二抗購自中杉金橋公司，DAPI染劑購自Sigma公司。MCT酶聯(lián)免疫試劑盒購自美國R＆D公司，熒光染色圖像采集使用NikonECLPSE TE2000－U系統(tǒng)。所有研究對象均知情同意，并且本研究獲得西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 患者癥狀評分及取材

IBS患者均行腹痛程度評分，評分標(biāo)準(zhǔn):0分為無腹痛癥狀;1分為腹痛輕微，不影響日常活動;2分為腹痛較輕，需要費勁才能忽視，日?；顒由胁恍枰{(diào)整;3分為腹痛較重，日?；顒邮苡绊懬倚枰{(diào)整;4分為腹痛嚴(yán)重，不能參加日?；顒印２⒂涗浧渌R床信息。所有的研究對象均進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查。內(nèi)鏡下無陽性表現(xiàn)者在距離肛門20－30 cm的乙狀結(jié)腸取活檢組織4塊，迅速置于液氮后放入－70℃冰箱保存。

1.3 肥大細(xì)胞計數(shù)

取1塊腸結(jié)腸黏膜標(biāo)本立即用10%甲醛固定8 h后置于30%蔗糖溶液4－6 h，OCT膠包埋后于冰凍切片機上切片，切片厚度為5μm。采用間接免疫熒光法對腸黏膜類胰蛋白酶進(jìn)行染色，MCT一抗孵育過夜后加入熒光二抗37℃孵育1 h。隨機連續(xù)計數(shù)3個高倍視野(400倍)內(nèi)MC數(shù)量，取平均值。為確定MCT細(xì)胞內(nèi)定位，二抗孵育結(jié)束后加入DAPI染液約3 min。

1.4 類胰蛋白酶含量測定

3塊腸黏膜活檢標(biāo)本稱重后、生理鹽水里漂洗、在2 ml Hank平衡鹽溶液置于37℃下孵育1 h，離心后取50μl上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法測定類胰蛋白酶水平，根據(jù)試劑盒說明書操作。每組標(biāo)本測量重復(fù)2次，取平均值，組胺濃度以μg/g組織質(zhì)量計算。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料的比較

共納入腹瀉型腸易激綜合征(D－IBS)患者34例，其中男性12例，女性22例，平均年齡(41±6.5)歲;納入健康對照15例，其中男性6例，女性9例，平均年齡(45±7.2)歲。健康對照包括3例無癥狀查體者，8例結(jié)腸息肉治療后復(fù)查者，4例有結(jié)直腸癌家族史，健康對照者均無消化道癥狀。所有納入者結(jié)腸鏡檢查均無陽性發(fā)現(xiàn)。

2.2 結(jié)腸肥大細(xì)胞分布及計數(shù)的比較

通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)類胰蛋白酶陽性的肥大細(xì)胞主要分布于健康對照和D－IBS患者結(jié)腸黏膜的固有層(圖1，見第668頁)，位于黏膜層腺體之間，在黏膜上皮和腺體內(nèi)分布很少。使用類胰蛋白酶對肥大細(xì)胞標(biāo)記(圖2A，見第668頁)后，用DAPI對細(xì)胞核染色(圖2B，見第668頁)發(fā)現(xiàn)類胰蛋白酶位于肥大細(xì)胞胞質(zhì)(圖2C，見第668頁)。通過對肥大細(xì)胞計數(shù)統(tǒng)計學(xué)比較發(fā)現(xiàn)腹瀉型腸易激綜合征患者肥大細(xì)胞計數(shù)明顯高于正常對照(P=0.004，見表1)。

表1 D-IBS患者與健康對照肥大細(xì)胞計數(shù)及類胰蛋白酶含量的比較Table 1 Comparison of mast cell counts and MCT contents between D-IBS patients and healthy controls

2.3 腹瀉型IBS肥大細(xì)胞與癥狀相關(guān)性的比較

所有腹瀉型IBS患者均出現(xiàn)腹痛、腹瀉癥狀，腹痛程度的評分為(1.94±0.89)分，平均病程為(61.2±52.0)月。通過與肥大細(xì)胞計數(shù)的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)腹瀉型IBS患者腹痛程度與肥大細(xì)胞計數(shù)呈正相關(guān)(r=0.35，P=0.04)，而肥大細(xì)胞計數(shù)與病程無明顯相關(guān)性(r=0.15，P=0.38，見圖3)。

2.4 腸黏膜類胰蛋白酶水平的比較

本實驗通過ELISA發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞脫顆粒產(chǎn)物組胺在健康對照結(jié)腸黏膜的濃度為(0.045±0.018)μg/g組織，在腹瀉型腸易激綜合征患者結(jié)腸黏膜的濃度為(0.083±0.025)μg/g組織，通過統(tǒng)計學(xué)比較本實驗發(fā)現(xiàn)D－IBS組胺水平明顯高于健康對照(P＜0.01，見表1)。

3 討論

腸易激綜合征主要變現(xiàn)為腹痛、大便習(xí)慣改變等癥狀，病因和發(fā)病機制尚不清楚，在腸易激綜合征患者腸黏膜很少發(fā)現(xiàn)病理改變。大量的研究證實了肥大細(xì)胞在腸易激綜合征特別是腹瀉型患者中增多，提示肥大細(xì)胞在腸易激綜合征發(fā)病中發(fā)揮作用。本研究證實D－IBS患者腸黏膜肥大細(xì)胞增多與腹痛程度相關(guān)，同時肥大細(xì)胞產(chǎn)物類胰蛋白酶含量增高。肥大細(xì)胞通常通過參與腸道炎癥和過敏反應(yīng)在腸道疾病中發(fā)揮作用，而肥大細(xì)胞活化后會釋放類胰蛋白酶、組胺、白三烯、P物質(zhì)等產(chǎn)物，這些炎癥因子會通過與腸道黏膜受體結(jié)合調(diào)節(jié)內(nèi)臟感知、運動等生理過程。

本實驗通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞在DIBS患者中增高，這與以往的研究結(jié)果一致［3］。說明肥大細(xì)胞增多是IBS患者腸道發(fā)生的病理改變之一。但是肥大細(xì)胞增加的機制尚不明確，原因之一可能與腸道黏膜免疫反應(yīng)有關(guān)，當(dāng)腸道存在食物過敏、腸道感染等抗原刺激時，肥大細(xì)胞作為抗原感受器參與腸道黏膜的免疫調(diào)節(jié)，這在以往的研究中已經(jīng)證實［6］。另一個可能的機制與心理應(yīng)激有關(guān)，當(dāng)應(yīng)激發(fā)生時，CRF分泌增加并直接作用腸黏膜肥大細(xì)胞促使其釋放活性介質(zhì)［7］，多個動物實驗發(fā)現(xiàn)應(yīng)激可以引起腸黏膜肥大細(xì)胞的增加，提示肥大細(xì)胞參與腦腸軸對內(nèi)臟敏感性的調(diào)節(jié)［8］。

本研究發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞主要位于結(jié)腸黏膜固有層腺體之間，這與腸道神經(jīng)纖維分布一致，已有研究證實肥大細(xì)胞與腸黏膜神經(jīng)纖維的距離與腸易激綜合征的發(fā)生有關(guān)［9］。同時腸道神經(jīng)存在肥大細(xì)胞產(chǎn)物的受體，當(dāng)這些受體活化后可以通過多種方式參與內(nèi)臟感知和運動的調(diào)節(jié)，如組胺可以作用于神經(jīng)纖維的H1受體改變腸道的肌電活動［10］，而肥大細(xì)胞直接分泌的化學(xué)介質(zhì)間接改變腸道神經(jīng)原的痛覺閾值并引起腹痛的發(fā)生［11］。本實驗通過酶聯(lián)免疫吸附實驗發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞產(chǎn)物之一的類胰蛋白酶在結(jié)腸黏膜含量增多，而類胰蛋白酶主要分布于肥大細(xì)胞，它可以作用于蛋白激活酶受體PAR-2發(fā)揮作用［12］。而有研究發(fā)現(xiàn)PAR-2表達(dá)于腸道神經(jīng)元，其活化后通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與調(diào)節(jié)內(nèi)臟感知，腸黏膜通透性以及腸道動力等生理過程［13］。

本實驗通過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)結(jié)腸黏膜肥大細(xì)胞增多與D-IBS患者腹痛的程度有關(guān)，提示肥大細(xì)胞可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)臟敏感性參與IBS的發(fā)生，而近期一項臨床研究證實肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定劑酮替芬可以緩解腸易激患者腹痛等癥狀［14］，而多項動物實驗也證實當(dāng)肥大細(xì)胞活化后大鼠內(nèi)臟敏感性增加［15，16］，這充分說明了肥大細(xì)胞脫顆粒產(chǎn)物促進(jìn)腹痛的發(fā)生。但是本實驗并未發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞計數(shù)與D－IBS患者的病程有相關(guān)性，研究者推測腸易激綜合征患者腸黏膜肥大細(xì)胞活化是一過性的反應(yīng)，只有存在感染、心理應(yīng)激時才會出現(xiàn)，當(dāng)這些誘發(fā)因素消失時，并不出現(xiàn)累積性的效應(yīng)，因此與病程的長短并無關(guān)聯(lián)。

本研究證實了腹瀉型腸易激綜合征患者結(jié)腸黏膜肥大細(xì)胞明顯高于健康對照，同時發(fā)現(xiàn)這與腹痛嚴(yán)重程度有關(guān)，肥大細(xì)胞可能通過活化后其類胰蛋白酶等產(chǎn)物含量增高調(diào)節(jié)內(nèi)臟感覺而參與腸易激綜合征的發(fā)生。因此，肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑等以腸道肥大細(xì)胞作為靶點的藥物為腸易激綜合征患者提供了新的治療選擇。

圖3 肥大細(xì)胞計數(shù)的比較及與D－IBS患者癥狀相關(guān)性的比較Figure 3 Comparison of mast cell counts between D-IBSpatients and healthy controls，and its correlation with symptoms in D-IBSpatients

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