針刺聯(lián)合紫杉醇對肺癌小鼠P－GP、CYP2C8蛋白表達的影響*

遼寧中醫(yī)藥大學針灸推拿學院

陳佳麗 成澤東 李春日 張志星 張小卿 陳以國 (沈陽110032)

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。目前，安全、有效的“針藥并舉”綜合療法成為抗肺癌治療的重要手段之一，以往的研究已經(jīng)證實針刺特定穴位能增加相應(yīng)器官藥物“靶向”作用，［1－4］但缺乏對其內(nèi)在機理的研究，因此，本實驗通過分析針刺對紫杉醇藥物代謝相關(guān)蛋白P－GP、CYP2C8 活性的影響，試圖闡明針刺協(xié)同增效的主要機制，開辟針藥結(jié)合研究藥代動力學及其機理的新方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 千分電子天枰［賽多利斯科學儀器(北京)有限公司］，移液槍(北京吉爾森科技有限公司)，高速勻漿機(IKA T10 basic)，TCL－16 高速臺式冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)，WH－2 微型漩渦混合儀(上海瀘西分析儀器廠有限公司);elisa 試劑盒(上海博谷生物科技有限公司)，生理鹽水，紫杉醇注射液(哈藥集團生物工程有限公司，國藥準字H2005996)。

1.2 實驗動物與分組 選擇7 周齡，雌性BALB/C 系小鼠72 只，小鼠由上海思萊克實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號:SCXK (滬)2007－0005，動物合格證號:2007000535185。將小鼠隨機分為4 組，每組18 只，即模型對照組 (第1組):腹腔注射紫杉醇同體積生理鹽水;針刺肺俞組(第2 組):腹腔注射紫杉醇同體積生理鹽水，針刺“肺俞”穴;紫杉醇藥物組(第3 組):腹腔注射紫杉醇;針刺肺俞+紫杉醇藥物組(第4 組):腹腔注射紫杉醇，針刺“肺俞”穴。

1.3 動物模型的建立 采用NTCU (N－nitroso－tris－chloroethylurea)誘發(fā)小鼠肺鱗狀細胞癌造模法。［5］具體方法:室溫控制在21℃±2℃，空氣定期用紫外線消毒，墊料高壓滅菌。動物自由飲水和攝食，飲冷開水，用每日新鮮蒸熱的標準混合飼料。小鼠背部刮毛，采用NTCU (溶解于丙酮)涂抹小鼠背部皮膚，25 μL (0.04 M NTCU)，周兩次，每周刮毛1 次，第8 個月造模結(jié)束。組織學檢查確認造模成功。

1.4 處理因素

1.4.1 針刺治療:時間，給藥前針刺;方法，選用“華佗牌”38 號針灸針(0.18 mm×25 mm)，針刺第2 組、第4 組，順經(jīng)30°角斜刺，刺入皮下2 mm，接6805－A 型電針儀，施以疏密波，頻率2 Hz，強度2～4 mA，留針15 min。每日1 次，連續(xù)5 次。模型對照組和紫杉醇藥物組均與施加因素組同樣捆綁在小鼠固定架上，以保持外界因素一致。以上穴位選取參照全國針灸學會實驗針灸研究會制定的《實驗動物針灸穴位圖譜》取穴。

1.4.2 藥物治療:時間，最后1 次針刺后立即給藥;根據(jù)人臨床推薦用量及不同種屬之間藥物劑量的換算法，確定小鼠的給藥劑量為紫杉醇6 mg/kg，將紫杉醇注射液用生理鹽水稀釋至0.6 mg/mL，腹腔注射給藥。

1.5 取材與處理 肺臟、肝臟、腎臟組織elisa試劑盒樣品:給藥后1、2、8 h 每一時間點取6 只小鼠眼球取血處死，取樣，用電子天枰分別稱取各臟器100 mg 置于1 mL 的EP 管中，加入0.8 mL 生理鹽水低溫下高速勻漿，渦旋1 min，將勻漿液以5 000 r/min 高速離心5 min，提取上清液。

1.6 指標檢測 檢測小鼠不同組肺臟、肝臟、腎臟組織中P－GP、CYP2C8 的含量。具體檢測過程嚴格按照elisa 試劑盒說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 小鼠不同治療組、不同時間點肺、肝、腎臟組織中的P－GP 含量的比較 肺、肝、腎臟器組織中相同治療組不同時間點P－GP 含量的比較，差異無顯著性(P＞0.05);相同時間點不同治療組P－GP 含量的比較，藥物組和針刺肺俞加藥物組明顯低于模型組(P＜0.01);針刺肺俞加藥物組P－GP 含量與藥物組相比差異有顯著性(P＜0.05);而針刺肺俞組與模型組比較，差異無顯著性(P＞0.05)。見圖1、圖2、圖3。

圖1 小鼠肺臟中1、2、8 h 各組中P－GP 含量的比較

圖2 小鼠肝臟中1、2、8 h 各組中P－GP 含量的比較

圖3 小鼠腎臟中1、2、8 h 各組中P－GP 含量的比較

2.2 小鼠不同治療組、不同時間點肺、肝、腎臟組織中CYP2C8 含量的比較 小鼠各臟器相同治療組1、2、8 hCYP2C8 的含量差異無顯著性(P＞0.05);不同治療組相同時間點組織中CYP2C8含量的比較，模型組組織中CYP2C8 的濃度最高，與藥物組和針刺加藥物組比較，差異有非常顯著性(P＜0.01);針刺肺俞加藥物組的CYP2C8 濃度最低，與藥物組相比差異有顯著性(P＜0.05);模型組與針刺肺俞組比較差異無顯著性 (P＞0.05)。如圖4、圖5、圖6。

圖4 小鼠肺臟中1、2、8 h 各組中CYP2C8 含量的比較

圖5 小鼠肝臟中1、2、8 h 各組中CYP2C8 含量的比較

圖6 小鼠腎臟中1、2、8 h 各組中CYP2C8 含量的比較

3 討論

3.1 P－GP 的表達與肺癌化療藥物紫杉醇的關(guān)系 P－GP 分布在許多組織(如血－腦屏障、腎、肝、肺、脾等)的上皮細胞，屬于ABC 類載體，它能夠與ATP 結(jié)合，并利用ATP 跨膜轉(zhuǎn)運物質(zhì)。P糖蛋白具有調(diào)節(jié)藥物在組織中滲透和加快藥物從組織消除的功能，［6］是影響藥物體內(nèi)過程最主要的轉(zhuǎn)運子，紫杉醇主要受P 糖蛋白介導的外排作用，P糖蛋白的表達和組織分布決定紫杉醇的吸收、分布和清除。本實驗結(jié)果顯示:與模型組比較，單純針刺組P－GP 含量變化不顯著，說明單純針刺可能與P－GP 的表達不相關(guān);與模型組和單純針刺組比較，藥物組和針刺藥物組各臟器中P－GP 的含量明顯降低，且針刺藥物組中的含量最低，提示紫杉醇藥物使P－GP 的含量減少，且針刺抑制了PGP 的表達，減慢了紫杉醇的藥物代謝，從而增加了肺癌的治療作用。

3.2 CYP2C8 與肺癌化療藥物紫杉醇的關(guān)系CYP2C8 是一種重要的CYP 酶，是藥物生物轉(zhuǎn)化Ⅰ相反應(yīng)的限速酶，它參與了很多臨床治療意義重大的藥物的代謝過程，這些藥物涉及到抗腫瘤藥物、降糖藥物、心血管藥物等。其中以抗腫瘤藥物—紫杉醇最為重要。紫杉醇主要受CYP2C8 的代謝，［7］轉(zhuǎn)化為無活性的代謝產(chǎn)物而被清除。上述實驗結(jié)果表明，針刺明顯減少了經(jīng)藥物注射后小鼠各臟器中CYP2C8 的含量，抑制了紫杉醇的藥物代謝，提高治療效果。

本實驗還觀察到1、2、8 h 各組中P－GP 及CYP2C8 的含量變化不顯著(P＞0.05)，提示時間可以不作為P－GP 及CYP2C8 含量檢測的影響因素。

［1］成澤東，陳以國，張利泰.針刺對大鼠體內(nèi)中藥有效成分趨向性影響的實驗研究［J］.中國針灸，2002，22 (1):51－53

［2］陳以國，成澤東，陳明明.針刺對紫杉醇在Lewis 肺癌小鼠體內(nèi)分布趨向性影響的實驗研究［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2009，27 (8):1 584－1 587

［3］成澤東，陳以國.針刺聯(lián)合紫杉醇對小鼠Lewis 肺癌細胞凋亡相關(guān)因子p53、bcl－2 蛋白表達的影響［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2007，14 (5):23－24

［4］成澤東，陳以國.針刺聯(lián)合紫杉醇對小鼠Lewis 肺癌細胞凋亡的影響［J］.針刺研究，2007，32 (6):135－157

［5］Wang Y.，Zhang Z.，Yan Y.，Lemon W.J.，LaRegina M.，Morrison C.，Lubet R.，You M.，A chemically induced model for squamous cell carcinoma of the lung in mice:histopathology and strain susceptibility［J］.Cancer Res，2004，64:1 647－1 654

［6］Srinivas E.，Murthy J.N.，Rao A.R.，Sastry G.N.，Recent advances in molecular modeling and medicinal chemistry aspects of phospho－glycoprotein ［J］.Curr Drug Metab，2006，7:205－217

［7］Gustafson D.L.，Long M.E.，Bradshaw E.L.，Merz A.L.，Kerzic P.J.，P450 induction alters paclitaxel pharmacokinetics and tissue distribution with multiple dosing ［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2005，56:248－254