熱帶靈芝研究進(jìn)展

劉 戈，馮 昆，趙 靜

(澳門大學(xué)中華醫(yī)藥研究院，澳門大學(xué)中藥質(zhì)量研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國 澳門 999078)

靈芝是一種擁有數(shù)千年藥用歷史的中國傳統(tǒng)珍稀藥用真菌，具有很高的藥用價(jià)值，屬于擔(dān)子菌綱 (Basidiomycetes)、多孔菌目 (Polyporales)、靈芝科 (Ganodermataceae)、靈芝屬 (Ganoderma)，靈芝屬包括大約80種，我國有44種。熱帶靈芝Ganoderma tropicum(Jungh.)Bres.，在分類學(xué)上屬于靈芝科、靈芝屬真菌。近年來，隨著對(duì)靈芝屬研究的逐漸深入，對(duì)熱帶靈芝的研究也逐漸增多。熱帶靈芝主要分布在中國、印度尼西亞、馬來西亞和新加坡4個(gè)國家[1－4]，在中國主要分布在云南[5]、海南[6]和臺(tái)灣[7]等地。熱帶靈芝在民間多自采自用，具有滋補(bǔ)、強(qiáng)壯、抗腫瘤的功能，福建民間也有報(bào)道稱用它可以治療冠心病[2，3]。本文將從熱帶靈芝的培養(yǎng)方式、化學(xué)成分及分析方法、藥理功能等方面對(duì)熱帶靈芝的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 培養(yǎng)方式

目前研究的熱帶靈芝菌種一般經(jīng)過野外采集后組織分離得到。熱帶靈芝的鑒定一般采取形態(tài)學(xué)鑒定和PCR表征鑒定。張東柱[8]等曾對(duì)熱帶靈芝子實(shí)體和菌絲體形態(tài)進(jìn)行了觀察研究，發(fā)現(xiàn)其成熟孢子不同于赤芝 (Ganoderma lucidum)的卵形孢子，而呈紡錘形 (圖1，劉戈制作)，子實(shí)體偶呈扇面形。Utomo等[9]通過使用特異性引物和 PCR－PFLP，對(duì)rDNA進(jìn)行鑒定，從而分辨出熱帶靈芝。

熱帶靈芝的培養(yǎng)研究主要集中在固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)2個(gè)方面。

1.1 固體培養(yǎng)

在培養(yǎng)基的選擇方面，鄧軍等[10]報(bào)道，熱帶靈芝在木屑、蔗渣、廢棉等主料的培養(yǎng)基上都能正常生長，見表1。

表1 不同固體栽培培養(yǎng)基比較

從表1可以看出，蔗渣74%、麥麩25%、過磷酸鈣1%、桑枝屑73%、麥麩25%、白糖1%、過磷酸鈣1%的栽培配方產(chǎn)量較高，分別達(dá)到 219.76 g·kg－1和 191.26 g·kg－1，完全使用廢棉種栽培熱帶靈芝產(chǎn)量較低，但是其中加入適量麥麩可以提高產(chǎn)量。劉國民等[11]通過米飯培養(yǎng)基、大腸桿菌顯色培養(yǎng)基 (CA)和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)組織分離熱帶靈芝，均得到純化的菌絲體;米飯培養(yǎng)基上的菌絲體生長速度最快，其次為PDA培養(yǎng)基，CA培養(yǎng)基上菌絲體生長最慢;在繼代培養(yǎng)中，PDA培養(yǎng)基的菌絲生長表現(xiàn)仍優(yōu)于CA培養(yǎng)基，原因在于CA培養(yǎng)基適合細(xì)菌的生長，不適合熱帶靈芝 (大型真菌)菌絲體的生長。

在培養(yǎng)條件的選擇方面，劉國民等[11]采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行因變量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種方法、接種菌種量和菌種質(zhì)量均對(duì)其培養(yǎng)有很大影響。在固體平板培養(yǎng)中，菌絲生長最適pH為5.9，菌絲生長的最適溫度為28.8℃。季節(jié)因素考察方面，反季節(jié)栽培容易產(chǎn)生畸形芝，而氣溫回升之后子實(shí)體生長發(fā)育便正常，能長成掌狀菌蓋。由此可見，熱帶靈芝的菌絲體生長發(fā)育、出芝過程以及出芝后子實(shí)體的生長均需要一個(gè)較高的溫度。子實(shí)體的形成和生長需要100 lx～200 lx的光照，無光照則不能形成菌蓋，但菌絲生長階段不需要光照，如果光照超過100 lx對(duì)菌絲體生長有極顯著的抑制作用[10]。

在熱帶靈芝的培養(yǎng)過程中，碳元素含量減少而氮元素含量升高。培養(yǎng)前期，木質(zhì)素的分解速度快于半纖維素和纖維素，后期則相反，最終碳元素以二氧化碳的形式散失，這一現(xiàn)象與胞外酶的產(chǎn)生和積累息息相關(guān)。纖維素酶的高峰出現(xiàn)在子實(shí)體形成過程中期，且淀粉酶的活性在培養(yǎng)前期較高，20 d時(shí)達(dá)高峰。纖維素酶的活性變化規(guī)律與纖維素的降解規(guī)律趨于一致，多酚氧化酶變化規(guī)律不明顯，所以尚不能肯定多酚氧化酶活性與木質(zhì)素降解的關(guān)系。在可溶性糖的方面，木糠麥麩培養(yǎng)基中可溶性糖的含量，在接種后10 d內(nèi)由2.26%降為1.69%。而子實(shí)體形成過程中，基質(zhì)中的可溶性糖含量逐漸增加，最終達(dá)到2.84%。其原因可能前期菌絲體積累過程需要消耗大量的碳源，而后期出芝過程中菌絲體分泌出分解酶類，使淀粉、木質(zhì)纖維素分解成為可溶性糖類，還有可能是菌絲體自身分泌出可溶性糖和菌絲體本身的溶解。另外，相同條件下熱帶靈芝子實(shí)體中鍺元素含量高于赤芝，這表明熱帶靈芝對(duì)鍺元素的富集能力更強(qiáng)[11]。

1.2 液體培養(yǎng)

劉國民等[11]采用MS(輕唾瓊脂培養(yǎng)基)，加入肌醇100 mg·L－1、煙酸0.5 mg·L－1、鹽酸硫胺素2.0 mg·L－1、鹽酸吡哆素1.0 mg·L－1、甘氨酸 2.0 mg·L－1、6－BA 1.0 mg·L－1、IBA 1.0 mg·L－1、蔗糖30 g·L－1，pH 5.8 條件下能夠培養(yǎng)熱帶靈芝。Law[12]通過對(duì)5種培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)比，得出在25℃的大豆提取物中培養(yǎng)15 d熱帶靈芝菌絲體，能夠獲得最高水平的菌絲體量和多糖產(chǎn)量。同時(shí)Tong等[13]還證實(shí)，在馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中加入不同濃度的Ge元素，隨著添加Ge元素含量的增加，菌絲對(duì)Ge的利用也增加，菌絲中Ge元素的含量也隨之增加。

2 化學(xué)成分及分析方法

已有文獻(xiàn)報(bào)道，熱帶靈芝中主要含有多糖、三萜、蛋白質(zhì)以及微量元素等4種物質(zhì)，具體情況見表2。

表2 熱帶靈芝化學(xué)成分與藥理活性

續(xù)表

2.1 多糖

在熱帶靈芝的總糖含量研究中，鄧軍等[10]采用蒽酮法，在共同栽培對(duì)比試驗(yàn)中，熱帶靈芝子實(shí)體的水溶性多糖含量約為赤芝子實(shí)體的1/4，多糖含量為0.408%。Buon[12]對(duì)熱帶靈芝中糖的分子量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果為27 000 Da。Aryantha等[16]采用TLC法對(duì)酸水解后的熱帶靈芝與赤芝的單糖進(jìn)行了對(duì)比，兩者均含有不同濃度的葡萄糖、半乳糖、木糖和鼠李糖。之后，Xin等[18]采用HPTLC法，對(duì)酸水解后的熱帶靈芝進(jìn)行分析，熱帶靈芝子實(shí)體含有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、巖藻糖和葡糖醛酸。

2.2 三萜類

Aryantha等[16]于2001年報(bào)道，用三氯化銻和利伯曼－布夏德試劑分別作顯色劑，顯色后在366 nm紫外下對(duì)相同條件培養(yǎng)得到的赤芝和熱帶靈芝子實(shí)體進(jìn)行TLC對(duì)比分析，熱帶靈芝與赤芝的三萜類成分類似，并且與赤芝相比，熱帶靈芝含有更多種類的三萜類物質(zhì)。同年，Su等[21]通過HPLC法，使用Lichrosphere 100 C－18 column(300 mm ×4.6 mm，5 μm)色譜柱對(duì)6種不同產(chǎn)地的熱帶靈芝中的靈芝酸B、C2含量進(jìn)行測(cè)定，含量分別為 0.0940 mg·g－1～ 0.143 3 mg·g－1和0.0312 mg·g－1～ 0.1052 mg·g－1。2006 年，Wang 等[20]采用HPLC法也對(duì)福州產(chǎn)地的熱帶靈芝中6種靈芝酸含量進(jìn)行測(cè)定，這是目前為止對(duì)熱帶靈芝中三萜類成分最完全的定性及定量報(bào)道。2013年，Hu等[24]首次對(duì)熱帶靈芝子實(shí)體中的醇提物進(jìn)行分離，得到3種羊毛甾醇型三萜類物質(zhì)，分別為3β，7β，15β－三羥基－11，23－二氧代羊毛脂 －8，16－二烯－26酸、3β，7β，15β－三羥基－11，23－二氧代羊毛脂－8，16－二烯－26－酸甲基酯、3β，15β－二羥基－7，11，23－三氧代羊毛脂－8，16－二烯－26酸甲基酯 (圖2)。

2.3 其它

鄧軍等[10]采用鹽酸水解法，使用氨基酸分析儀對(duì)栽培得到的熱帶靈芝子實(shí)體進(jìn)行定量分析，熱帶靈芝與赤芝相同，均含有天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸等17種氨基酸，其中含有賴氨酸、蛋氨酸等9種人體必需氨基酸，且含量是赤芝的2倍左右，他們還對(duì)熱帶靈芝中礦質(zhì)元素進(jìn)行原子吸收分析，證明熱帶靈芝中含有Ge、Cu、Fe等礦質(zhì)元素。另外，Aryantha[16]曾報(bào)道猜測(cè)熱帶靈芝中含有麥角甾醇。

3 藥理功能

在熱帶靈芝的藥理活性研究中，抗腫瘤、保肝、降血糖等研究均有報(bào)道。在熱帶靈芝抗腫瘤作用研究中，Choong等[14]對(duì)赤芝、熱帶靈芝以及松杉靈芝 (Ganoderma tsugae)藥理活性對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，熱帶靈芝菌絲體水提物對(duì)正常細(xì)胞無毒性，但能夠誘導(dǎo)人體乳腺癌細(xì)胞MDAMB－435凋亡和壞死。熱帶靈芝的水提物也具有誘導(dǎo)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡作用，Sadava等[15]研究指出，其主要作用機(jī)理是其水提物能夠提升含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3的活性，而含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶能夠作用在半胱氨酸殘基，它選擇性地切割蛋白質(zhì)進(jìn)而造成細(xì)胞凋亡。

在熱帶靈芝保肝研究領(lǐng)域，臺(tái)北醫(yī)學(xué)大學(xué)楊依珍以四氯化碳誘發(fā)小白鼠急性肝障礙的模式，并以谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (GPT)及組織切片的方法來評(píng)估18種靈芝類物質(zhì)中三萜類對(duì)急性肝障礙的效果。結(jié)果證明，熱帶靈芝在以相同劑量加藥3次后，排除肝障礙的效果最好[34]。

Bastami等[35]報(bào)道熱帶靈芝具有調(diào)節(jié)胰島素分泌和降血糖作用，在口服葡萄糖耐藥試驗(yàn)中，1 g·kg－1體重的粗提物就顯示明顯的降低血糖作用;熱帶靈芝粗提物對(duì)大鼠胰腺β－細(xì)胞系的 IC50值為100 μg·mL－1;在30 min的急性胰島素分泌測(cè)試中，熱帶靈芝粗提物也顯示出具有提高胰島素分泌的作用，這些結(jié)果都表明，熱帶靈芝粗提物具有升高胰島素和降低血糖活性的作用。

另外，Hu等[24]分離出的化合物3β，7β，15β－三羥基－11，23－二氧代羊毛脂－8，16－二烯－26－酸甲基酯，被證明具有一定的乙酰膽堿酶活性抑制作用。而乙酰膽堿與心血管系統(tǒng)存在重要的相互作用。人的腦組織中有大量的乙酰膽堿，隨著年齡的增加，乙酰膽堿的含量會(huì)減少，繼而容易誘發(fā)帕金斯癥、阿爾茨海默病等疾病，抑制乙酰膽堿酶，可以延緩乙酰膽堿的減少，提高人腦內(nèi)的乙酰膽堿含量，促進(jìn)腦神經(jīng)傳導(dǎo)功能，改善腦功能，提高記憶力[36，37]。

4 結(jié)語

一直以來，靈芝都是中藥學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，但研究多集中在赤芝和紫芝 (Ganoderma sinense)2種靈芝上。近幾年來，越來越多的研究工作者已經(jīng)開始了靈芝屬其它種類靈芝的研究，除了對(duì)熱帶靈芝的研究之外，如Huang等[38]對(duì)于松杉靈芝對(duì)肝損失保護(hù)和Yu等[39]對(duì)松杉靈芝抗肺癌的研究也都顯示出較好的藥理活性。僅從目前的研究結(jié)果來說，熱帶靈芝具有與赤芝相似的化學(xué)成分及相似的藥理活性[40]，并且在治療急性肝障礙[34]等方面較赤芝有更好藥理活性，具有很高的研究價(jià)值。但是，目前對(duì)熱帶靈芝的研究遠(yuǎn)不如赤芝和紫芝深入，有很多方面包括藥理活性、發(fā)酵培養(yǎng)、化學(xué)成分及分析方法等都值得進(jìn)一步深入研究。例如，一方面增加其藥理活性方面的研究，如熱帶靈芝是否同赤芝一樣，具有免疫調(diào)節(jié)作用[41]、抗病毒、抗衰老[42]等藥理作用;另一方面，可以在熱帶靈芝菌絲體液體發(fā)酵方面進(jìn)行研究，以更快捷廉價(jià)地獲得靈芝活性成分，確定熱帶靈芝的品質(zhì)控制方法并保障其質(zhì)量。

[1]卯曉嵐.中國大型真菌[M].鄭州:河南科學(xué)技術(shù)出版社，2000:499.

[2]趙繼鼎.中國靈芝新編 [M].北京:科學(xué)出版社，1989:149－153.

[3]《中華本草》編委會(huì).中華本草 (第三卷)[M].上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999:543.

[4]高建莉，禹志領(lǐng)，李紹平，等.靈芝三萜類成分研究進(jìn)展 [J].中國食用菌，2005，24(4):6－11.

[5]向黎元，尹復(fù)元，吳洵鳳.云南野生靈芝及液體培養(yǎng)[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，23(1):19－20.

[6]李海蛟，何雙輝，崔寶凱.海南霸王嶺自然保護(hù)區(qū)多孔菌研究[J].菌物學(xué)報(bào)，2010，29(6):828－833.

[7]安寶貞，蔡志濃，張東柱，等.臺(tái)灣果樹及木本觀賞植物立枯型真菌性病害之調(diào)查與分布 [J].Plant Pathology Bulletin，2005(14):203－210.

[8]張東柱.靈芝與熱帶靈芝子實(shí)體形態(tài)與菌絲純培養(yǎng)之比較 [J].林業(yè)試驗(yàn)所研究報(bào)告季刊，1991，6(4):397－406.

[9]Utomo C，Werner S，Niepold F，et al.Identification of Ganoderma，the causal agent of basal stem rot disease in oil palm using a molecular method [J].Mycopathologia，2005(159):159－170.

[10]鄧軍，莫天硯.熱帶靈芝的生理特性研究及化學(xué)成分分析[J].廣西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1992，11(4):15－23.

[11]劉國民，吳興亮，李娟玲，等.野生熱帶靈芝Ganoderma tropicum(Jungh.)Bres.菌種分離與馴化研究 [J].海南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2009，27(1):24－29.

[12]Jong LB.Production and properities of polysaccharides from mycelia of three Ganoderma species [J].University putra Malaysia，1999(5):9.

[13]Chow Chin Tong，Pei Joo Chong.Mycelial growth and Germanium uptake by four species of Ganoderma [J].Pertanika Journal of Tropical Agricultural Science，1996，19(2/3):171－174.

[14]Yew Keong Choong，Mohamed Mustapha Noordin，Suhaila Mohamed，et al.The nature of apoptosis of human breast cancer cells induced by three species of genus Ganoderma P.Karst.(Aphyllophoromycetideae)crude extracts [J].International Journal of Medicinal Mushrooms，2008，10(2):115－125.

[15]David Sadava，David WS，Ryan RM，et al.Effect of Ganoderma on drug－sensitive and multidrug－resistant small－cell lung carcinoma cells [J].Cancer letters，2009，227(2):182－189.

[16]INyoman PA，Andi A，Suswini K.Occurrence of triterpenoids an polysaccarides on Ganoderma tropicum with Ganoderma lucidum as reference [J].Australasian Mycologist，2001，20(2):123－129.

[17]Pavel Tomsik，Tomas Soukup，Eva Cermakova，et al.L－rhamnose and L －fucosesuppress cancer growth in mice [J].Central European Journal of Biology，2011(5):1－9.

[18]Xin Di，Kelvin KCC，Hei Wun Leung，et al.Fingerprint profiling of acid hydrolyzates of polysaccharide extracted from the fruiting bodies and spores of Lingzhi by high performance thin layer chromatography[J].Journal of Chromatography A，2003，1018(1):85－95.

[19]徐旋里.甘露糖對(duì)急性肺損傷的保護(hù)作用及其通過甘露糖受體抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥 [M].浙江:浙江大學(xué)，2008.

[20]Xiao Ming Wang，Ming Yang，Shu Hong Guan，et al.Quantitative determination of six major triterpenoids in Ganoderma lucidum and related species by high performance liquid chromatography [J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2006，41(7):838－844.

[21]Ching Hua Su，Yi Zhen Yang，Hsiu－O Ho，et al.High－performance liquid chromatographic analysis for the characterization of triterpenoids from Ganoderma [J].Journal of Chromatographic Science，2001(39):93－100.

[22]羅俊，林志彬.靈芝三萜類化合物藥理作用研究進(jìn)展 [J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2002，37(7):574－577.

[23]Xiao Yu Gu，Dan Liu，Min Ye，et al.Structural characterization of minor metabolites and pharmacokinetics of ganoderic acid C2in rat plasma by HPLC coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry [J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2012，75(5):64－73.

[24]Li Li Hu，Qing Yun Ma，Sheng Zhuo Huang，et al.Three new lanostanoid triterpenes from the fruiting bodies of Ganoderma tropicum[J].Journal of Asian Natural Products Research，2013，15(4):357－362.

[25]陳若蕓.靈芝化學(xué)研究[C]//中國菌物學(xué)會(huì)首屆藥用真菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展暨學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.江蘇:中國菌物學(xué)會(huì)藥用真菌專業(yè)委員會(huì)，2006.

[26]張智.D型絲氨酸調(diào)節(jié)大鼠海馬穩(wěn)態(tài)可塑性的機(jī)制研究 [M].安徽:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)，2008.

[27]史瑞紅.谷氨酸通過活化脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞參與痛覺敏感的作用觀察[M].山西:山西醫(yī)科大學(xué)，2011:4.

[28]張中偉.谷氨酸誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的初步探討及mGLP－1對(duì)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[M].廣東:華東師范大學(xué)，2010:2.

[29]宋文婷，徐立，劉建勛.腦缺血后谷氨酸及其受體介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷及相關(guān)藥物研究進(jìn)展 [J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2012，28(6):747－750.

[30]呂尚軍.谷氨酰胺、甘氨酸及甘谷二肽對(duì)燒傷大鼠心肌保護(hù)作用及其信號(hào)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究 [M].重慶:第三軍醫(yī)大學(xué)，2007:10.

[31]劉振平，申晶，宋曉艷.L－丙氨酸對(duì)INS－1E細(xì)胞胰島素分泌功能的影響 [J].天津醫(yī)藥，2011，39(2):159－161.

[32]田慧，師永生，張舒靜，等.纈氨酸對(duì)肝纖維化的影響 [J].中國醫(yī)療前沿，2011，6(7):18－19.

[33]劉瀏，楊冬華，湯紹輝.異亮氨酸改善上消化道出血患者肝臟和肌肉蛋白合成功能 [J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2007，87(22):1563.

[34]楊依珍.靈芝屬三萜類成分之分布模式與對(duì)肝功能及HL－60細(xì)胞之影響 [M].中國臺(tái)灣:臺(tái)灣醫(yī)學(xué)大學(xué)醫(yī)學(xué)研究所，1995.

[35]Bastami MS，Bohari SPM，Har WM，et al.Hypoglycemic，insulinotrophic and cytotoxic activity of three species of Ganoderma [J].Malaysian Journal of Science，2007，26(2):41－46.

[36]Elaine KP，Michael Curtis，David JD，et al.Cholinergic correlates of cognitive impairment in Parkinson's disease:comparisons with Alzheimer's disease [J].Journal of Neurology，Neurosurgery，and Psychiatry，1985(48):413－421.

[37]Guy S，Salvesen，Vishva MD.Caspases:intracellular signaling by proteolysis [J].Cell，1997(91):443－446.

[38]Chi Chang Huang，Wen Ching Huang，Suh Ching Yang，et al.Ganoderma tsugae hepatoprotection against exhaustive exercise－induced liver injury in rats [J].Molecules，2013(18):1741－1754.

[39]Yang Hao Yu，Han Peng Kuo，Hui Hsia Hsieh，et al.Ganoderma tsugae induces S phase arrest and apoptosis in doxorubicin－resistant lung adenocarcinoma H23/0.3 cells via modulation of the PI3K/Akt signaling pathway [J].Evidence－based Complementary and Alternative Medicine，2012(5):1－13.

[40]Jamal Mahajna，Nesly Dotan，Ben Zion Zaidman，et al.Pharmacological values of medicinal mushrooms for prostate cancer therapy:the case of Ganoderma lucidum [J].Nutrition and cancer，2011，61(1):16－26.

[41]Jane Ramberg，Erika Nelson，Robert Sinnott.Immunomodulatory dietary polysaccharides:a systematic review of the literature [J].Nutrition Journal，2010，9(54):1－22.

[42]張曉云，楊春清.靈芝的化學(xué)成分和藥理作用 [J].國外醫(yī)藥植物藥分冊(cè)，2006，21(4):152－154.