酒石酸長春瑞濱的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法驗(yàn)證

嵇海澄??王倜??王春玲??李孝壁

[摘要] 目的 參考USP、EP，探討并建立酒石酸長春瑞濱的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)與檢查方法（凝膠法）。 方法 按《中國藥典》（2010年版）二部附錄ⅪE細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法進(jìn)行。 結(jié)果 經(jīng)驗(yàn)證，酒石酸長春瑞濱的細(xì)菌內(nèi)毒素限值確定為L<2.0IU/mg（以長春瑞濱計(jì)），通過稀釋法可消除干擾，無干擾濃度為0.035mg/mL（以長春瑞濱計(jì)）。 結(jié)論 可按此標(biāo)準(zhǔn)采用本法對本品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

[關(guān)鍵詞] 酒石酸長春瑞濱；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法驗(yàn)證；凝膠法

[中圖分類號] R927 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 2095-0616（2014）21-105-03

酒石酸長春瑞濱（vinorelbine tartrate）化學(xué)名3，4-二去氫-4-去氧-8-去甲長春堿二酒石酸鹽，屬于長春堿類抑制細(xì)胞分裂的抗腫瘤藥物，主要通過抑制微管蛋白的聚合，使細(xì)胞分裂停止于有絲分裂中期[1]，是一細(xì)胞周期特異性的藥物。臨床上主要與其他抗癌藥物聯(lián)合應(yīng)用于治療非小細(xì)胞肺癌，也可用于晚期乳腺癌[2-5]、食管癌等。FDA于1994年批準(zhǔn)酒石酸長春瑞濱用于晚期非小細(xì)胞肺癌患者的一線治療。無菌檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查、微生物限度檢查是藥品安全性檢查的重要項(xiàng)目[6]。

本品制劑為酒石酸長春瑞濱注射液，其國內(nèi)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為《中國藥典》，明確規(guī)定了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的項(xiàng)目與標(biāo)準(zhǔn)[7]。酒石酸長春瑞濱目前國內(nèi)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為《中國藥典》，現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)中未規(guī)定細(xì)菌內(nèi)毒素的控制項(xiàng)目與標(biāo)準(zhǔn)[7]。為更好地控制制劑的細(xì)菌內(nèi)毒素水平，對酒石酸長春瑞濱原料開展建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查標(biāo)準(zhǔn)與方法的研究，參照《中國藥典》（2010年版）二部附錄ⅪX M化學(xué)藥品注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則及附錄ⅪE細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[7]、USP（85）BACTERIAL ENDOTOXIN TEST[8]、EP（2.1.6.4）BACTERIAL ENDOTOXIN TEST[9]以及EP8.0中酒石酸長春瑞濱細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)[10]、USP37-NF32中酒石酸長春瑞濱注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)[11]，建立并驗(yàn)證本品種的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查標(biāo)準(zhǔn)與方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

電子分析天平、DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、XW-80A旋渦混合器、DK-600電熱恒溫水槽、HH-2F凈化工作臺。

1.2 試劑

1.2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品 規(guī)格160EU/支，批號150601-201174，中國藥品生物制品檢定所。

1.2.2 鱟試劑 鱟試劑1（λ=0.03EU/mL，規(guī)格0.1mL/支，批號1211022，湛江安度斯生物有限公司）；鱟試劑2（λ=0.03EU/mL，規(guī)格0.1mL/支，批號12060612，福州新北生化工業(yè)有限公司）。

1.2.3 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水WBET 規(guī)格50mL/瓶，批號13020315，褔州新北生化工業(yè)有限公司。

1.2.4 堿性pH調(diào)節(jié)劑 規(guī)格2mL/支，批號121127，褔州新北生化工業(yè)有限公司。

1.2.5 酒石酸長春瑞濱 批號：130701、130702、130901。

2 方法（凝膠法）

2.1 試驗(yàn)準(zhǔn)備

試驗(yàn)過程所用的移液槍等儀器設(shè)備必須經(jīng)過確認(rèn)并在有效期內(nèi)；玻璃、不銹鋼等容器及用具經(jīng)250℃，至少1h干熱滅菌以去除外源性內(nèi)毒素；塑料器具須經(jīng)清洗并確證不干擾試驗(yàn)結(jié)果；所用的標(biāo)準(zhǔn)品、試劑均在有效期內(nèi)，鱟試劑初次使用前須進(jìn)行靈敏度復(fù)核。

2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素限值L

酒石酸長春瑞濱注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)CP2010、USP37-NF32中分別為按長春瑞濱計(jì)，L<6.0EU/mg（CP2010）與L<3.0IU/mg（USP37-NF32）；EP8.0中酒石酸長春瑞濱的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)為L<2.0IU/mg（以長春瑞濱計(jì)）。綜上所述，本次驗(yàn)證取L<1.0IU/mg（以長春瑞濱計(jì)）。

2.3 鱟試劑靈敏度復(fù)核

按《中國藥典》（2010年版）二部附錄ⅪE細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法“鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)”項(xiàng)下規(guī)定進(jìn)行，所用2批鱟試劑的實(shí)測靈敏度λc與標(biāo)示靈敏度λ均一致（0.5λ≤λc≤2.0λ），均符合規(guī)定。

2.4 供試品最低有效活性濃度C計(jì)算

當(dāng)最大有效稀釋倍數(shù)為1時，相對應(yīng)的濃度即為最低有效活性濃度（Cp），按Cp=λ/L計(jì)算，一般取C>Cp，本次驗(yàn)證C取0.035mg/mL（以長春瑞濱計(jì)）。

2.5 干擾試驗(yàn)

2.5.1 供試品溶液（NPC）的制備 精密稱取酒石酸長春瑞濱（批號130701）適量，用WBET溶解成含長春瑞濱為10mg/mL的溶液，并用pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH為6.0～8.0，用WBET稀釋制成濃度為C的供試品溶液。

2.5.2 細(xì)菌內(nèi)毒素內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液（PC）和細(xì)菌內(nèi)毒素供試品溶液（（PPC）制備 用1mL WBET將1支內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶解后，在旋渦混合器連續(xù)混合15min后，分別用WBET和NPC稀釋成2λ、λ、0.5λ、0.25λ的PC和PPC。在進(jìn)行下一步稀釋前，至少混合30s。

2.5.3 干擾試驗(yàn)過程 取鱟試劑1、2各38支，分別用0.1mL WBET溶解，再分別加入2λ、λ、0.5λ、0.25λ濃度的PC和PPC各0.1mL混和，每一濃度平行做四份。同時用0.1mL WBET平行做2份陰性對照，用0.1mL NPC平行做4份陰性對照。將安瓿中溶液輕輕混勻后封閉管口，垂直放入電熱恒溫水槽中，從放入開始準(zhǔn)確記錄時間，在（37±1）℃無振動保溫（60±2）min。試驗(yàn)結(jié)果見表1。

另取130702、130901批酒石酸長春瑞濱同前操作。試驗(yàn)結(jié)果見表2。endprint

從表1、2可見，用兩個廠家的鱟試劑對酒石酸長春瑞濱進(jìn)行干擾試驗(yàn)，結(jié)果均符合0.5λ≤ES≤2λ，0.5 Es≤Et≤2.0Es。此結(jié)果表明，酒石酸長春瑞濱對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查（凝膠法）無干擾的濃度為0.035mg/mL（以長春瑞濱計(jì)）。

3 結(jié)果

對3批酒石酸長春瑞濱進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果均符合規(guī)定。見表3。

4 討論

經(jīng)試驗(yàn)，酒石酸長春瑞濱的細(xì)菌內(nèi)毒素限值確定為L<2.0IU/mg（以長春瑞濱計(jì)），酒石酸長春瑞濱對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查（凝膠法）無干擾的濃度為0.035mg/mL（以長春瑞濱計(jì)）。

在本試驗(yàn)條件下，取3個批號的供試品，用BET水分別按上述方法配制成0.035mg/mL供試品稀釋液，然后用λ=0.03EU/mL的上述兩個廠家的鱟試劑各16支實(shí)驗(yàn)，供試品的Et值均在0.5 Es～2.0Es范圍之間，確認(rèn)無干擾影響。酒石酸長春瑞深經(jīng)過按細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法實(shí)驗(yàn)后，確證了本品可以用稀釋方法排除干擾，用細(xì)菌內(nèi)毒素查法（凝膠法）對供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

當(dāng)細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、鱟試劑、供試品的生產(chǎn)工藝或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生任何可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時，需重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。

供試品溶液和鱟試劑混和液的pH值一般在6.0～8.0之間，在檢測前應(yīng)通過加入合適的pH調(diào)節(jié)劑進(jìn)行pH調(diào)節(jié)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Okouneva T，Hill BT，Wilson L，et al.The effects of vinflunine vinorelbine，and vinblastine on centromere dynamics[J].Mol Cancer Ther，2003，2（5）：427-436.

[2] Bryan AF，Trailokya NP.Safety and efficacy of vinorelbine in the treatment of non-small cell lung cancer[J].Clin Med Insights On-col，2011，5（10）：131-144.

[3] Gregory RK ，Smith IE.Vinorelbine-a clinical review[J].Br J Cancer，2000，82（12）：1907-1913.

[4] Crawford J.Vinorelbine（navelbine） in non-small cell lung cancer [J].Future directions Lung Cancer，1995，12（3）：311.

[5] Poletti P，Bettini AC，Caremoli ER，et al.Liposomal-encapsulated dox-orubicin（MyocetTM，D-99）and vinorelbine in previously treated metastatic breast cancer patients a feasibility study [J].Tumori，2008，94（5）：686-690.

[6] 許玉華、杜娟、湯楊.藥品微生物污染檢測方法驗(yàn)證的必要性[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2005，6（4）：46.

[7] 國家藥典委員會編.中國藥典（2010年版）二部[S]北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：1.

[8] USP〈85〉BACTERIAL ENDOTOXIN TEST、USP37-NF，32.

[9] EP〈2.1.6.4〉BACTERIAL ENDOTOXIN TEST、EP8.0.

[10] Vinorelbine Tartrate、EP8.0（Page 3205）、EDQM（歐洲藥品質(zhì)量委員會）編輯，2014年1月生效.

[11] Vinorelbine Injection、USP37- NF 32（5158 Vinorelbine/ Official Monographs）、The United States Pharmacopeial Convention編輯出版，2014年5月1日生效.

[12] 中國藥品生物制品檢定所/中國藥品檢驗(yàn)總所.中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：351-389.

（收稿日期：2014-07-22）endprint

從表1、2可見，用兩個廠家的鱟試劑對酒石酸長春瑞濱進(jìn)行干擾試驗(yàn)，結(jié)果均符合0.5λ≤ES≤2λ，0.5 Es≤Et≤2.0Es。此結(jié)果表明，酒石酸長春瑞濱對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查（凝膠法）無干擾的濃度為0.035mg/mL（以長春瑞濱計(jì)）。

3 結(jié)果

對3批酒石酸長春瑞濱進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果均符合規(guī)定。見表3。

4 討論

經(jīng)試驗(yàn)，酒石酸長春瑞濱的細(xì)菌內(nèi)毒素限值確定為L<2.0IU/mg（以長春瑞濱計(jì)），酒石酸長春瑞濱對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查（凝膠法）無干擾的濃度為0.035mg/mL（以長春瑞濱計(jì)）。

在本試驗(yàn)條件下，取3個批號的供試品，用BET水分別按上述方法配制成0.035mg/mL供試品稀釋液，然后用λ=0.03EU/mL的上述兩個廠家的鱟試劑各16支實(shí)驗(yàn)，供試品的Et值均在0.5 Es～2.0Es范圍之間，確認(rèn)無干擾影響。酒石酸長春瑞深經(jīng)過按細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法實(shí)驗(yàn)后，確證了本品可以用稀釋方法排除干擾，用細(xì)菌內(nèi)毒素查法（凝膠法）對供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

當(dāng)細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、鱟試劑、供試品的生產(chǎn)工藝或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生任何可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時，需重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。

供試品溶液和鱟試劑混和液的pH值一般在6.0～8.0之間，在檢測前應(yīng)通過加入合適的pH調(diào)節(jié)劑進(jìn)行pH調(diào)節(jié)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Okouneva T，Hill BT，Wilson L，et al.The effects of vinflunine vinorelbine，and vinblastine on centromere dynamics[J].Mol Cancer Ther，2003，2（5）：427-436.

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[5] Poletti P，Bettini AC，Caremoli ER，et al.Liposomal-encapsulated dox-orubicin（MyocetTM，D-99）and vinorelbine in previously treated metastatic breast cancer patients a feasibility study [J].Tumori，2008，94（5）：686-690.

[6] 許玉華、杜娟、湯楊.藥品微生物污染檢測方法驗(yàn)證的必要性[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2005，6（4）：46.

[7] 國家藥典委員會編.中國藥典（2010年版）二部[S]北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：1.

[8] USP〈85〉BACTERIAL ENDOTOXIN TEST、USP37-NF，32.

[9] EP〈2.1.6.4〉BACTERIAL ENDOTOXIN TEST、EP8.0.

[10] Vinorelbine Tartrate、EP8.0（Page 3205）、EDQM（歐洲藥品質(zhì)量委員會）編輯，2014年1月生效.

[11] Vinorelbine Injection、USP37- NF 32（5158 Vinorelbine/ Official Monographs）、The United States Pharmacopeial Convention編輯出版，2014年5月1日生效.

[12] 中國藥品生物制品檢定所/中國藥品檢驗(yàn)總所.中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：351-389.

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從表1、2可見，用兩個廠家的鱟試劑對酒石酸長春瑞濱進(jìn)行干擾試驗(yàn)，結(jié)果均符合0.5λ≤ES≤2λ，0.5 Es≤Et≤2.0Es。此結(jié)果表明，酒石酸長春瑞濱對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查（凝膠法）無干擾的濃度為0.035mg/mL（以長春瑞濱計(jì)）。

3 結(jié)果

對3批酒石酸長春瑞濱進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果均符合規(guī)定。見表3。

4 討論

經(jīng)試驗(yàn)，酒石酸長春瑞濱的細(xì)菌內(nèi)毒素限值確定為L<2.0IU/mg（以長春瑞濱計(jì)），酒石酸長春瑞濱對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查（凝膠法）無干擾的濃度為0.035mg/mL（以長春瑞濱計(jì)）。

在本試驗(yàn)條件下，取3個批號的供試品，用BET水分別按上述方法配制成0.035mg/mL供試品稀釋液，然后用λ=0.03EU/mL的上述兩個廠家的鱟試劑各16支實(shí)驗(yàn)，供試品的Et值均在0.5 Es～2.0Es范圍之間，確認(rèn)無干擾影響。酒石酸長春瑞深經(jīng)過按細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法實(shí)驗(yàn)后，確證了本品可以用稀釋方法排除干擾，用細(xì)菌內(nèi)毒素查法（凝膠法）對供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

當(dāng)細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、鱟試劑、供試品的生產(chǎn)工藝或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生任何可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時，需重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。

供試品溶液和鱟試劑混和液的pH值一般在6.0～8.0之間，在檢測前應(yīng)通過加入合適的pH調(diào)節(jié)劑進(jìn)行pH調(diào)節(jié)。

[參考文獻(xiàn)]

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[3] Gregory RK ，Smith IE.Vinorelbine-a clinical review[J].Br J Cancer，2000，82（12）：1907-1913.

[4] Crawford J.Vinorelbine（navelbine） in non-small cell lung cancer [J].Future directions Lung Cancer，1995，12（3）：311.

[5] Poletti P，Bettini AC，Caremoli ER，et al.Liposomal-encapsulated dox-orubicin（MyocetTM，D-99）and vinorelbine in previously treated metastatic breast cancer patients a feasibility study [J].Tumori，2008，94（5）：686-690.

[6] 許玉華、杜娟、湯楊.藥品微生物污染檢測方法驗(yàn)證的必要性[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2005，6（4）：46.

[7] 國家藥典委員會編.中國藥典（2010年版）二部[S]北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：1.

[8] USP〈85〉BACTERIAL ENDOTOXIN TEST、USP37-NF，32.

[9] EP〈2.1.6.4〉BACTERIAL ENDOTOXIN TEST、EP8.0.

[10] Vinorelbine Tartrate、EP8.0（Page 3205）、EDQM（歐洲藥品質(zhì)量委員會）編輯，2014年1月生效.

[11] Vinorelbine Injection、USP37- NF 32（5158 Vinorelbine/ Official Monographs）、The United States Pharmacopeial Convention編輯出版，2014年5月1日生效.

[12] 中國藥品生物制品檢定所/中國藥品檢驗(yàn)總所.中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：351-389.

（收稿日期：2014-07-22）endprint