注射用蘭索拉唑細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)研究

秦序鋒??王開穎

[摘要] 目的 建立注射用蘭索拉唑細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查方法。 方法 采用凝膠法，按《中國(guó)藥典》2010年版關(guān)于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行結(jié)果判斷。 結(jié)果 注射用蘭索拉唑與鱟試劑及細(xì)菌內(nèi)毒素不存在干擾。 結(jié)論 凝膠法可以用來檢測(cè)注射用蘭索拉唑的細(xì)菌內(nèi)毒素。

[關(guān)健詞] 注射用蘭索拉唑；細(xì)菌內(nèi)毒素；凝膠法

[中圖分類號(hào)] R927.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 2095-0616（2014）21-24-03

注射用蘭索拉唑（規(guī)格：30mg）為白色至類白色疏松塊狀物。主要用于口服療法不適用的伴有出血的十二指腸潰瘍。蘭索拉唑?qū)儆谫|(zhì)子泵抑制劑，本藥分布于胃黏膜壁細(xì)胞的酸性環(huán)境后，轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘拇x物。這種代謝物與存在于酸生成部位的H+-K+-ATP酶的巰基結(jié)合，通過抑制H+-K+-ATP酶的活性而抑制酸分泌。

1 儀器與試藥

1.1 藥品

注射用蘭索拉唑（浙江佐力藥業(yè)股份股份有限公司，20130501、20130502、20130503，規(guī)格：30mg）。

1.2 試藥

TAL（Ⅰ：福州新北生化工業(yè)有限公司， 12020913，靈敏度0.125 EU/支；Ⅱ：湛江安度斯生物有限公司，1205035，靈敏度0.125 EU/支）；BET檢查用水（湛江安度斯生物有限公司，1212080，規(guī)格：5mL/支）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品[1-2]（中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)院，1206，120EU/支）。

1.3 儀器

GHP-9270型恒溫器（上海一恒公司）；ZH-2型旋渦混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；BD-2CD型垂直凈化工作臺(tái)（杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司）；HWC-300型數(shù)顯恒溫水浴箱（南京環(huán)科試驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 限值計(jì)算[3-4]

根據(jù)注射用蘭索拉唑臨床使用說明書，本品臨床使用劑量每小時(shí)為30mg，根據(jù)內(nèi)毒素限值計(jì)算公式：L=K/M， 其中L為供試品內(nèi)毒素限值，K為5EU/（kg·h），M為人體每公斤體重每小時(shí)最大用藥量。中國(guó)人按照平均體重60kg計(jì)算，人體表面積按1.62m2，注射時(shí)間不足1h按1h計(jì)。根據(jù)公式計(jì)算限值結(jié)果為10EU/mg，為保證臨床用藥安全，我們將限值定為5EU/mg。

2.2 鱟試劑靈敏度復(fù)核[5]

取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品加WBET溶解后混合15min，按照下列稀釋方法進(jìn)行稀釋。

即得0.03EU/mL的濃度，分別制成2λ，λ，0.5λ，0.25λ四個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一濃度平行做四管，每一步稀釋均應(yīng)在混合器上旋渦混勻

30s，同時(shí)做2支陰性對(duì)照管。加樣后用封口膜封口，輕輕振動(dòng)混勻，放入（37±1）℃的恒溫器內(nèi)，保溫（60±2）min后觀察結(jié)果。見表1。

判斷方法：將試管返轉(zhuǎn)180°。

陽(yáng)性： 凝膠不變形，倒立凝膠不脫落陰性：無凝膠或凝膠不完全，倒立凝膠膠落。

結(jié)果顯示，兩批鱟試劑經(jīng)復(fù)核，結(jié)果均符合0.5λ≤λc≥2λ，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

2.3 確定最大有效稀釋倍數(shù)[1]

最大稀釋倍數(shù)的公式MVD=CL/λ，C為供試品的濃度（取本品1支，加BET檢查用水6mL，濃度為5mg/mL溶液），根據(jù)市售的鱟試劑靈敏度多在0.25～0.03EU/mL之間，因此注射用蘭索拉唑的最大稀釋倍數(shù)為MVD=（5mg/mL×5EU/mg）/0.03EU/mL=833倍，因此注射用蘭索拉唑的MVD稀釋倍數(shù)為50～800倍。

2.4 干擾預(yù)試驗(yàn)[6]

取批號(hào)20130501注射用蘭索拉唑做干擾預(yù)試驗(yàn)。用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將注射用蘭索拉唑供試品溶液進(jìn)行逐級(jí)稀釋，制得50倍、100倍、200倍、400倍、800倍系列稀釋液，作為供試品陰性對(duì)照（NPC）。另配制與NPC相同濃度梯度的供試品溶液，每個(gè)濃度添加等體積細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，制得每個(gè)濃度均含2λ細(xì)菌內(nèi)毒素的系列溶液，作為供試品陽(yáng)性對(duì)照（PPC）。每個(gè)濃度平行做兩管，同時(shí)作陽(yáng)性對(duì)照（PC）、陰性對(duì)照（NC），同時(shí)取2個(gè)廠家靈敏度0.25EU/mL的鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn)。見表2

判斷標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)陰性對(duì)照為陰性，陽(yáng)性對(duì)照為陽(yáng)性時(shí)，實(shí)驗(yàn)有效。當(dāng)系列濃度中出現(xiàn)供試品溶液2管為陰性，供試品陽(yáng)性對(duì)照管2管為陽(yáng)性時(shí)，則認(rèn)為供試品在該濃度下不干擾實(shí)驗(yàn)，此稀釋濃度即為最小不干擾稀釋濃度。選擇該稀釋濃度進(jìn)行干擾試驗(yàn)。由表2可知，注射用蘭索拉唑稀釋50倍以上可以消除對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的干擾。

2.5 干擾試驗(yàn)[7-10]

參照干擾預(yù)試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果，取2個(gè)不同生產(chǎn)廠家的鱟試劑（靈敏度0.125EU/mL），取注射用蘭索拉唑，加BET檢查用水稀釋制成0.05mg/mL的溶液進(jìn)行干擾試驗(yàn)。分別用供試品溶液和BET水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成含2λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ系列濃度的溶液，同時(shí)平行做2管進(jìn)行BET水及供試品的陰性對(duì)照，按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。見表3。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）陰性管為陰性；（2）供試品管為陰性；（3）0.5λ≤Es≥2λ。

由結(jié)果可知，采用供試品溶液（0.05mg/mL）進(jìn)行干擾試驗(yàn)， Es結(jié)果均在范圍之內(nèi)，說明采用靈敏度為0.125EU的鱟試劑對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾。

2.6 注射用蘭索拉唑細(xì)菌內(nèi)毒素檢查[11]

取三批注射用蘭索拉唑，采用0.25EU/mL鱟試劑靈敏度，依照中國(guó)藥典2010版二部附錄Ⅺ E法進(jìn)行檢查。見表4。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，NC和NPC均為陰性；PPC和PC均為陽(yáng)性，供試品均為陰性，3批樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素均符合規(guī)定，說明該方法可用于注射用蘭索拉唑細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查。endprint

3 討論

本試驗(yàn)在10萬(wàn)級(jí)背景下進(jìn)行。潔凈區(qū)及物體表面擦拭消毒，空調(diào)凈化系統(tǒng)能正常啟動(dòng)并保持良好運(yùn)行，塵埃粒子和沉降菌檢測(cè)結(jié)果符合潔凈級(jí)別要求[12]。

實(shí)驗(yàn)過程中使用的玻璃器血，洗凈后應(yīng)密閉于金屬容器中，放置于250℃電熱干燥箱中，干燥時(shí)間不少于0.5h，以保證除去內(nèi)毒素。工作帽、手套、口罩要預(yù)先消毒滅菌。樣品加樣結(jié)束后，應(yīng)輕輕振動(dòng)混勻，避免產(chǎn)生氣泡，并放入（37±1）℃的恒溫器中，保溫時(shí)間（60±2）min。

為了保證臨床使用更加安全，我們將內(nèi)毒素限值定為5EU/mg。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水是指內(nèi)毒素含量小于0.015EU且對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾的滅菌注射用水。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是通過鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素在體外起凝膠反應(yīng)的機(jī)制而完成的，因其所具有的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，目前已被各國(guó)藥典所采納，作為替代熱原檢查法的一種檢測(cè)方法用于控制注射劑的質(zhì)量。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 曹麗梅，肖麗華，劉明理.細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品研制技術(shù)規(guī)范的介紹[J].中國(guó)藥事，2013，27（11）：1201-1202.

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[12] 馬莉，張凇，王安航，等.細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)方法的常見問題剖析[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2013，33（9）：733-734.

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本試驗(yàn)在10萬(wàn)級(jí)背景下進(jìn)行。潔凈區(qū)及物體表面擦拭消毒，空調(diào)凈化系統(tǒng)能正常啟動(dòng)并保持良好運(yùn)行，塵埃粒子和沉降菌檢測(cè)結(jié)果符合潔凈級(jí)別要求[12]。

實(shí)驗(yàn)過程中使用的玻璃器血，洗凈后應(yīng)密閉于金屬容器中，放置于250℃電熱干燥箱中，干燥時(shí)間不少于0.5h，以保證除去內(nèi)毒素。工作帽、手套、口罩要預(yù)先消毒滅菌。樣品加樣結(jié)束后，應(yīng)輕輕振動(dòng)混勻，避免產(chǎn)生氣泡，并放入（37±1）℃的恒溫器中，保溫時(shí)間（60±2）min。

為了保證臨床使用更加安全，我們將內(nèi)毒素限值定為5EU/mg。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水是指內(nèi)毒素含量小于0.015EU且對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾的滅菌注射用水。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是通過鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素在體外起凝膠反應(yīng)的機(jī)制而完成的，因其所具有的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，目前已被各國(guó)藥典所采納，作為替代熱原檢查法的一種檢測(cè)方法用于控制注射劑的質(zhì)量。

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本試驗(yàn)在10萬(wàn)級(jí)背景下進(jìn)行。潔凈區(qū)及物體表面擦拭消毒，空調(diào)凈化系統(tǒng)能正常啟動(dòng)并保持良好運(yùn)行，塵埃粒子和沉降菌檢測(cè)結(jié)果符合潔凈級(jí)別要求[12]。

實(shí)驗(yàn)過程中使用的玻璃器血，洗凈后應(yīng)密閉于金屬容器中，放置于250℃電熱干燥箱中，干燥時(shí)間不少于0.5h，以保證除去內(nèi)毒素。工作帽、手套、口罩要預(yù)先消毒滅菌。樣品加樣結(jié)束后，應(yīng)輕輕振動(dòng)混勻，避免產(chǎn)生氣泡，并放入（37±1）℃的恒溫器中，保溫時(shí)間（60±2）min。

為了保證臨床使用更加安全，我們將內(nèi)毒素限值定為5EU/mg。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水是指內(nèi)毒素含量小于0.015EU且對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾的滅菌注射用水。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是通過鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素在體外起凝膠反應(yīng)的機(jī)制而完成的，因其所具有的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，目前已被各國(guó)藥典所采納，作為替代熱原檢查法的一種檢測(cè)方法用于控制注射劑的質(zhì)量。

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[7] 賈瑞波，劉靜，耿欣.注射用奈達(dá)鉑細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的建立[J].中國(guó)藥師，2014，17（2）：332-334.

[8] 王春玲，李孝壁，顏磊亭，等.注射用鹽酸吉西他濱細(xì)菌內(nèi)毒素方法驗(yàn)證[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2014，4（1）：123-125.

[9] 褚奇星.參麥注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的探討[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，11（8）：120-121.

[10] 吳麗敏，李玉基，魏霞，等.丁酸氯維地平細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].藥學(xué)研究，2013，32（12）：702-704.

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[12] 馬莉，張凇，王安航，等.細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)方法的常見問題剖析[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2013，33（9）：733-734.

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