中藥復骨方對糖皮質(zhì)激素致骨質(zhì)疏松骨折大鼠骨代謝及骨密度的影響

2014-11-18 10:16鄧偉坤李艷卿李敏研

中國當代醫(yī)藥 2014年29期

鄧偉坤++++李艷卿++++李敏研++++施靜雯

[摘要] 目的觀察中藥復骨方對糖皮質(zhì)激素致骨質(zhì)疏松骨折模型大鼠骨代謝及骨密度的影響。方法將48只SD大鼠隨機分為基礎(chǔ)組、模型組及治療組各16只。基礎(chǔ)組僅給予肌內(nèi)注射生理鹽水1 mg/kg，模型組和治療組予肌內(nèi)注射地塞米松1 mg/kg，1次/d，3次/周，用藥8周建立糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松（GIOP）模型。第8周末對3組大鼠手術(shù)造成單側(cè)股骨閉合性骨折，骨折處采用金屬內(nèi)固定，復制GIOP骨折模型。術(shù)后第2天開始治療組中藥復骨方藥液灌胃，持續(xù)8周。檢測大鼠血清鈣（Ca）、磷（P）、堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（BGP）指標，采用雙能X線吸收法（DXA）測量大鼠股骨骨密度。結(jié)果骨折術(shù)前，模型組大鼠骨密度值為（0.219±0.013） g/cm2，基礎(chǔ)組骨密度值為（0.283±0.015） g/cm2，模型組骨密度值明顯低于基礎(chǔ)組（t=12.8970，P<0.05）。實驗16周末，治療組股骨全長骨骨密度為（0.265±0.014） g/cm2，高于模型組（t=9.8403，P<0.05）。實驗12周末，治療組大鼠血清Ca為（2.35±0.19） mmol/L、P為（2.47±0.23） mmol/L、ALP為（196.74±25.38） U/L及BGP為（1.33±0.25） μg/L，與模型組比較均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論中藥復骨方可顯著提高GIOP骨折大鼠股骨骨密度，升高GIOP骨折大鼠血清Ca、P、ALP及BGP活性，促進骨形成，有助于GIOP骨折的愈合。

[關(guān)鍵詞] 復骨方；骨代謝；骨密度；糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松；骨折；大鼠

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）10（b）-0008-04

骨質(zhì)疏松是骨代謝障礙的一種全身性骨骼疾病，骨骼是動態(tài)變化的組織，骨轉(zhuǎn)換過程是破骨細胞吸收舊骨、成骨細胞形成類骨質(zhì)并進行礦化新骨的過程，當骨吸收大于骨形成就導致了骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松（glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP）是一種因內(nèi)源或外源糖皮質(zhì)激素所致的，以骨強度下降、骨折風險性增加為特征的代謝性骨病[1]，其發(fā)病率位居繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥首位[2]。骨轉(zhuǎn)換過程可以通過生化標志反映出來，間接顯示成骨細胞與破骨細胞的活性，與骨形成有關(guān)的代謝指標有堿性磷酸酶（ALP）和骨鈣素（BGP）等。本實驗擬以肌內(nèi)注射地塞米松致大鼠GIOP，并建立GIOP大鼠股骨閉合骨折模型，觀察中藥復骨方對模型大鼠骨代謝及骨密度的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物選取3個月齡雌性SD大鼠48只，清潔級，體質(zhì)量（280±20） g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（粵）2008-0002。實驗過程中，所有動物在同等清潔環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)房溫度為（24±1）℃，濕度為50%～70%，每天光照與黑暗時間各12 h，喂飼全價營養(yǎng)鼠飼料（購自廣東中醫(yī)藥大學實驗動物中心，合格證號：NO.11002900006734），自由進水。

1.1.2 實驗藥物實驗中藥復骨方由骨碎補、杜仲、續(xù)斷、千年健、紅花、歸尾、川芎等組成，藥材購自廣州大參林藥房，由廣州市番禺區(qū)何賢紀念醫(yī)院藥劑科藥房加工，藥物煎煮后濃縮到含生藥0.5 g/ml，4℃保存。地塞米松磷酸鈉注射液（天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司生產(chǎn)，國藥準字號H41021255，批號0807031，規(guī)格：1 ml∶5 mg）；生理鹽水（廣東科倫藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準字號H20045198，批號D12070311-2，規(guī)格：500 ml∶4.5 g）；青霉素（廣州白云山天心制藥股份有限公司生產(chǎn)，國藥準字號H20013260）；麻醉劑3.5%水合氯醛（天津科密歐化學試劑有限公司生產(chǎn)，批號20110514）。

1.1.3 試劑儀器血清鈣（Ca）、磷（P）、ALP試劑盒（批號：20130708、20131016、2130915，由南京建成生物技術(shù)公司提供）；血清BGP放免試劑盒（購自北京原子高科股份有限公司，批號：201311）。實驗儀器：日立7600全自動生化儀；離心機（型號：TDZ5-WS，長沙平凡儀器有限公司）；XH6080型放免儀（西安核儀廠）；雙能X線儀DEXA（LUNAR-DPXIQ型，美國GE Lunar公司）；骨折造模支架參照相關(guān)文獻[3]自制。

1.2 方法

1.2.1 建模方法將實驗動物隨機分為基礎(chǔ)組、模型組及治療組各16只。每周稱體質(zhì)量1次，并按體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量?；A(chǔ)組：肌內(nèi)注射生理鹽水1 ml/（kg·d），3次/周，8周后手術(shù)造成大鼠右側(cè)股骨骨折，骨折處采用金屬內(nèi)固定，術(shù)后3 d常規(guī)抗感染處理，每日肌內(nèi)注射1 000 000 U青霉素。術(shù)后第2天開始給予蒸餾水10 ml/kg灌胃，1次/d，持續(xù)8周。模型組：肌內(nèi)注射地塞米松1 mg/（kg·d），3次/周，持續(xù)8周，復制GIOP模型。8周末手術(shù)造成GIOP大鼠右側(cè)股骨骨折，骨折處采用金屬內(nèi)固定，術(shù)后常規(guī)抗感染處理同基礎(chǔ)組，術(shù)后第2天開始給予蒸餾水10 ml/kg 灌胃，1次/d，持續(xù)8周。治療組：前8周GIOP骨折造模及骨折術(shù)后抗感染處理同模型組。骨折術(shù)后第2天以復骨方藥液10 ml/kg灌胃給藥，1次/d，持續(xù)8周。

1.2.2 骨折手術(shù)方法應用3.5%水合氯醛（10 ml/kg）對實驗大鼠進行腹腔麻醉，縱行切開右下肢髕骨內(nèi)側(cè)皮膚（長0.6～0.8 cm）及部分股四頭肌腱性組織，將髕骨牽向外側(cè)使之脫位，暴露股骨髁間凹。用20號注射針自股骨髁間凹插入髓腔擴髓，然后取出，再逆行插入直徑1 mm克氏針，從大轉(zhuǎn)子及皮膚穿出，將內(nèi)固定針遠端埋于股骨髁間骨皮質(zhì)下，近端緊貼大轉(zhuǎn)子將尾部折彎，多余部分剪除后閉合切口。將動物右下肢外展內(nèi)旋位固定于造模支架的鐵砧凹槽上（鐵砧凹槽間距為15 mm），造模支架中柱下端的骨刀壓于大鼠股骨中部，助手提起500 g的砝碼，從至20 cm高處將砝碼自由落體撞向刀背，造成實驗大鼠股骨中段閉合性骨折[3]。

1.2.3 血樣本采集及血生化指標檢測方法實驗8周末骨折手術(shù)前1天及實驗12周末對3組動物采血。方法：以3.5%的水合氯醛溶液10 ml/kg腹腔注射麻醉，由腹主動脈取血，血樣靜置后2500 r/min離心20 min，分離出血清，置-40℃保存，按照試劑盒說明應用全自動生化儀檢測Ca、P和ALP含量，BGP活性采用放射免疫法檢測。

1.2.4 骨密度測定實驗8周末對基礎(chǔ)組和模型組的大鼠腹腔注射麻醉劑，采用雙能X線吸收法（DEXA）以LUNAR-DPXIQ型骨密度儀及所附帶的小動物軟件測量大鼠活體全身骨密度，驗證骨質(zhì)疏松模型的建立是否成功。16周末注射麻醉劑，處死大鼠，在無菌條件下取雙側(cè)股骨，剔除附著組織，拔除克氏針，4℃避光保存在70%乙醇中，應用DEXA分別測量右側(cè)股骨全長骨密度及骨痂骨密度（骨痂中點上下10 mm處骨密度）。骨密度采用單位面積內(nèi)的骨礦物質(zhì)含量表示（g/cm2）。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SSPS 12.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗大鼠骨密度的變化

實驗8周末骨折術(shù)前，模型組大鼠骨密度值為（0.219±0.013） g/cm2，基礎(chǔ)組骨密度值為（0.283±0.015） g/cm2，模型組骨密度值明顯低于基礎(chǔ)組，差異有統(tǒng)計學意義（t=12.8970，P<0.05），說明GIOP模型復制成功。實驗16周末，治療組股骨全長骨和骨痂骨密度均高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。模型組全長骨和骨痂骨密度均低于基礎(chǔ)組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表1）。

表1 實驗16周末3組大鼠股骨骨密度值的比較（g/cm2，x±s）

與基礎(chǔ)組比較，t=11.2532，*P<0.05；t=13.7601，#P<0.05；與模型組比較，t=9.8403，△P<0.05；t=9.4618，▲P<0.05

2.2 實驗中大鼠血清生化指標的改變

實驗8周末，GIOP造模期，模型組、治療組大鼠血清Ca、P含量及ALP、BGP活性與基礎(chǔ)組比較均顯著降低（P<0.05）；實驗12周末，治療組大鼠血清Ca、P含量及ALP、BGP活性與模型組比較均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；模型組大鼠血清Ca、P含量及ALP、BGP活性顯著低于基礎(chǔ)組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表2）。

表2 實驗中3組大鼠血清生化指標的比較（x±s）

與基礎(chǔ)組對應時間比較，*P<0.05；與基礎(chǔ)組8周末比較，#P<0.05；與模型組12周末比較，△P<0.05

3 討論

糖皮質(zhì)激素所致骨質(zhì)疏松癥是最常見的藥源性骨質(zhì)疏松[4]。美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）將骨質(zhì)疏松定義為一種以骨強度受損、骨折危險增加的骨骼疾病[5]，而骨強度是骨密度和骨質(zhì)量的綜合反映。骨密度即單位骨面積所含的骨礦物量，是反映骨強度與骨量的主要指標，是目前用于骨質(zhì)疏松診斷、骨折危險度評價的重要指標[6]。本實驗對大鼠肌內(nèi)注射地塞米松8周后，模型組大鼠骨密度顯著降低，血清生化檢查提示模型組大鼠血清Ca、P含量及ALP、BGP活性與基礎(chǔ)組比較均顯著降低，模型組骨代謝呈現(xiàn)一種低骨形成和高骨吸收的狀態(tài)，說明大鼠骨質(zhì)疏松模型復制成功，與國內(nèi)相關(guān)研究建模方法一致[7-9]。實驗16周末，治療組股骨全長骨和骨痂骨密度均高于模型組，說明復骨方治療可有效提高模型大鼠的骨密度，促進骨折的愈合。

骨折愈合是一個復雜而連續(xù)的生物學修復過程，受諸多因素的影響。血清ALP是成骨細胞分化的早期指標，是骨形成所必需的酶。ALP能分解有機磷酸化合物，促使無機磷酸鹽離子與鈣離子結(jié)合成磷酸鈣而沉淀于骨組織內(nèi)，成骨細胞分泌的ALP可以滲入血液，使血液ALP含量增加，ALP的活性?？商崾竟钦劬植考毎鲋澈突钴S的程度，因此血清ALP可作為骨重建活躍性改變的標志，是一項觀察骨折愈合的指標[10-11]。本實驗GIOP造模期，模型組大鼠血清ALP與基礎(chǔ)組比較顯著降低，說明糖皮質(zhì)激素可使大鼠血清中ALP活性顯著下降，從而抑制成骨細胞的作用，并加強骨吸收，導致骨質(zhì)疏松。在人為骨折4周后，為骨重建期和骨塑形期。本實驗選擇骨折術(shù)后經(jīng)采用復骨方中藥治療4周時采血測定血清生化指標，以觀察中藥對骨折骨重建期骨代謝的影響，結(jié)果顯示治療組大鼠血清ALP活性明顯高于模型組，由此可以推測，復骨方能提高骨折愈合重建時血清ALP的活性，增強骨折部位成骨細胞增殖，促進骨折愈合。復骨方由骨碎補、杜仲、續(xù)斷、千年健、紅花、歸尾、川芎等組成，研究發(fā)現(xiàn)[12]，骨碎補可能通過提高血鈣、磷的濃度，促進鈣、磷沉積，增強機體內(nèi)成骨細胞增殖活動，提高血清ALP的活性從而促進骨折愈合。

正常的骨代謝過程是通過消化道的吸收和排泌、腎臟的濾過和重吸收、骨骼的礦化和再吸收三方面的調(diào)節(jié)。鈣鹽在骨中沉積和骨中鈣鹽溶解的正常進行是維持血液中鈣磷含量穩(wěn)定的重要環(huán)節(jié)，血液中鈣磷含量的高低又直接影響骨的鈣化和溶解。糖皮質(zhì)激素能夠降低腸鈣吸收，并抑制腎鈣的再吸收，影響骨的礦化。趙亮等[13]研究發(fā)現(xiàn)，續(xù)斷可提高骨折愈合中血清ALP的活性，升高鈣磷沉積，促進骨形成。杜仲含有豐富膠原、磷、鈣鹽等微量元素，能激活骨折愈合過程中相關(guān)細胞釋放更多的ALP，提高血清ALP的活性，有利于骨質(zhì)修復[14]。具有補腎壯骨功效的中藥復骨方能提高模型大鼠血鈣水平，有助于新骨的形成或鈣化，并促進骨重建和骨折愈合。

BGP來源于骨組織，由成骨細胞合成并分泌到骨中，是骨組織中非膠原性蛋白的主要成分，約占骨質(zhì)蛋白的3%，其作用是調(diào)節(jié)和維持骨鈣[15]。部分BGP沉積于骨基質(zhì)，部分進入血液循環(huán)，因此，血清中BGP濃度可特異性地反映成骨細胞的活性[16]。本實驗結(jié)果顯示，實驗8周末，模型組大鼠血清中BGP的含量比基礎(chǔ)組顯著降低，說明長期應用糖皮質(zhì)激素造成大鼠成骨細胞的活性顯著降低，抑制骨形成。骨折術(shù)后，經(jīng)過4周治療，治療組大鼠血清中BGP的含量接近基礎(chǔ)組，明顯高于模型組，提示中藥復骨方可以使成骨細胞的活性增強，促進成骨細胞合成和分泌BGP，促進骨折愈合。

綜上所述，中藥復骨方灌胃治療可顯著提高GIOP骨折大鼠股骨骨密度，升高模型組大鼠血清Ca、P含量及ALP、BGP活性。中藥復骨方通過升高血Ca、P促進新骨的形成或鈣化，提高骨折愈合重建時血清ALP的活性，增強骨折部位成骨細胞的活性，促進成骨細胞合成和分泌BGP，提高GIOP骨折大鼠股骨骨密度，促進骨形成，有助于GIOP骨折的愈合。

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（收稿日期：2014-06-23 本文編輯：郭靜娟）