鹽酸法舒地爾對糖尿病性腎病的保護(hù)作用研究

聶榮杰，張波

(1.?？谑腥嗣襻t(yī)院 內(nèi)分泌科，海南 ?？?570100;2.南京醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)科學(xué)部，江蘇 南京 210029)

糖尿病性腎病是常見的糖尿病并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及到多種物質(zhì)代謝及血管活性因子、細(xì)胞生長因子等，因此比較難以治療［1-2］。Rho為Ras超家族中的一個亞群，普遍存在于哺乳動物組織細(xì)胞中，具有GTP酶活性，又被稱為Rho GTP酶(Rho guanosine triphosphatases，Rho GTPases)，是目前研究最為廣泛的酶［3］。Rho GTP酶有與GDP結(jié)合的激活態(tài)和與GTP結(jié)合的失活態(tài)2種形式［4］，在細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中2種狀態(tài)相互轉(zhuǎn)換，產(chǎn)生多種生物效應(yīng)，從而行使其生理功能。Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil forming protein kinase，ROCK)，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能夠與GTP-Rho相結(jié)合，是目前功能研究最為詳細(xì)的Rho下游靶效應(yīng)分子［5-7］。大量研究表明腎中Rho A/ROCK信號通路介導(dǎo)腎小管細(xì)胞等細(xì)胞支架的重構(gòu)，從而促使腎纖維化［8］。腎纖維化表現(xiàn)為細(xì)胞標(biāo)志物上皮鈣粘素的缺失和肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達(dá)［9］。法舒地爾是一種ROCK選擇性抑制劑［10］。國內(nèi)外對糖尿病動物模型進(jìn)行的研究［11-14］表明，法舒地爾可以減少尿蛋白、腎小球系膜外基質(zhì)堆積以及減輕腎小球硬化。但是目前法舒地爾對糖尿病性腎小管間質(zhì)病變的保護(hù)作用機(jī)制國內(nèi)外少有報道。因此本研究主要針對法舒地爾對高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化影響機(jī)制進(jìn)行研究，從而進(jìn)一步探究法舒地爾對糖尿病性腎病的保護(hù)作用機(jī)制，旨在為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)以及可行性指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和細(xì)胞株:選取清潔級雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量200～250 g，購自蒙古大學(xué)動物中心，動物許可證號:SCXK(蒙)2002-0001，給予正常飼料喂養(yǎng)。人近曲腎小管上皮細(xì)胞株HK-2購自北京協(xié)和技術(shù)所細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑:鹽酸法舒地爾(hydrochloride fasudil)，購自天津紅日藥業(yè)有限公司。胎牛血清、DMEM購自Hyclone公司。鼠抗人Rho A一抗購自英國Abcam公司。鼠抗人上皮鈣黏素一抗和鼠抗人α—SMA購自中杉金橋公司。Rho A配體結(jié)合沉淀試劑盒，購自Millipore公司。FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體和HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體購自Abcam公司。PI購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模:分組前確定大鼠血糖值均處于正常范圍內(nèi)。將36只SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組、糖尿病腎病模型組和鹽酸法舒地爾實驗組，每組大鼠12只。用60mg/kg STZ造模，將60mg/kg STZ注射于糖尿病腎病模型組、鹽酸法舒地爾實驗組大鼠進(jìn)行造模。糖尿病腎病模型組與鹽酸法舒地爾實驗組大鼠注射STZ 72h后，連續(xù)3 d檢測大鼠血糖，觀察造模是否成功(糖尿病造模成功標(biāo)準(zhǔn):尾血血糖≥16.7 mmol/L)。造模成功后，鹽酸法舒地爾實驗組的大鼠每天腹腔注射鹽酸法舒地爾(10mg/kg)，空白對照組及糖尿病模型組注射等量生理鹽水，3組持續(xù)注射12周，此期間3組動物在相同條件(光照、溫度、濕度等)下飼養(yǎng)。

1.2.2 指標(biāo)測定:實驗結(jié)束前24 h收集大鼠尿液，測定尿蛋白量;實驗結(jié)束后麻醉大鼠，心尖取血，測定尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(serum creatinin，Scr)指標(biāo)。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組:HK-2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。實驗隨機(jī)分為4組:A組(空白對照組)，將5.5 mmol/L的葡萄糖加入細(xì)胞培養(yǎng)液里;B組(高張組)，將5.5 mmol/L葡萄糖與54.5 mmol/L甘露醇加入細(xì)胞培養(yǎng)液;C組(高糖模型組)，將60 mmol/L［15］的葡萄糖加入細(xì)胞培養(yǎng)液;D組(鹽酸法舒地爾實驗組)，將60 mmol/L的葡萄糖與20μmol/L的鹽酸法舒地爾［16］加入細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.2.4 高糖對HK-2細(xì)胞Rho A活性的影響:將處于對數(shù)期生長的HK-2細(xì)胞采用無胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，加入60 mmol/L高糖培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)1、2、4、8、16、24 h 后將細(xì)胞裂解，根據(jù)Sterpetti P［17］方法，在Rho-GTP親和力測試板上孵育45 min，再與抗體檢測試劑孵育2 h，酶標(biāo)儀測定發(fā)光信號，每個時間段測量3次，觀察Rho A的活性。

1.2.5 鹽酸法舒地爾對高糖處理的HK-2細(xì)胞上皮鈣黏素表達(dá)的影響:將4組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后爬片，用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，0.1%TritonX-100溶液穿孔細(xì)胞后用10%正常羊血清37℃封閉1 h，滴加鼠抗人上皮鈣黏素一抗(1∶100)，4℃過夜孵育，次日清洗，滴加羊抗鼠IgG抗體(1∶200)，避光37℃孵育30 min，PI染色30 min，清洗后加入抗熒光淬滅封片劑封片，立即用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍片，每組選取3個視野清晰的圖像進(jìn)行分析，計算其表達(dá)量。

1.2.6 鹽酸法舒地爾對高糖處理的HK-2細(xì)胞α-SMA表達(dá)的影響:將處于對數(shù)期的細(xì)胞用無胎牛血清培養(yǎng)24 h，更換新培養(yǎng)液后分成A、B、C、D 4組，分別加入5.5 mmol/L的葡萄糖、5.5 mmol/L葡萄糖與甘露醇54.5 mmol/L、60.0 mmol/L的葡萄糖、60.0 mmol/L的葡萄糖與20μmol/L的鹽酸法舒地爾，培養(yǎng)72 h后提取細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳。恒流轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，分別加入GAPDH(1∶1000)和α-SMA(1∶200)一抗，4℃過夜。次日清洗，加入HRP標(biāo)記IgG(1∶1000)二抗，搖床孵育1 h，洗膜后將ECL試劑盒溶液中A和B液等量混合后加在PVDF膜表面，避光條件下反應(yīng)1 min，采用Odyssey自動曝光掃描并進(jìn)行結(jié)果分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)結(jié)果均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理，采用t檢驗或方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鹽酸法舒地爾對糖尿病腎病大鼠血液指標(biāo)的影響與空白對照組相比，糖尿病腎病模型組24 h尿蛋白、BUN和Scr含量均顯著升高(P＜0.01)，但鹽酸法舒地爾實驗組3指標(biāo)均較糖尿病腎病模型組明顯下降(P＜0.01，見表1)。

表1 3組大鼠血液指標(biāo)變化比較Tab.1 Comparision of rats blood parameters changes in three groups

2.2 高糖對HK-2細(xì)胞中RhoA活性的影響 高糖處理(60 nmol/L)HK-2 細(xì)胞2、4、8、16、24 h 的RhoA 活性明顯高于高糖處理0 h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。高糖處理后4 h時HK-2細(xì)胞RhoA活性最高(見表2)。

表2 高糖處理不同時間段RhoA蛋白表達(dá)變化Tab.2 Changes of expression of RhoA protein with high sugar treatment in different periods

2.3 鹽酸法舒地爾對高糖處理的HK-2細(xì)胞上皮鈣黏素及α-SMA表達(dá)的影響 細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，高糖模型組HK-2細(xì)胞內(nèi)上皮鈣粘素蛋白的表達(dá)量明顯低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。鹽酸法舒地爾實驗組HK-2細(xì)胞內(nèi)上皮鈣粘素蛋白表達(dá)量高于高糖模型組低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。培養(yǎng)72 h后，高糖模型組HK-2細(xì)胞內(nèi)α-SMA蛋白的表達(dá)量高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。鹽酸法舒地實驗組HK-2細(xì)胞內(nèi)α-SMA蛋白表達(dá)量低于高糖模型組，高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見表3)。

表3 上皮鈣粘素與α-SMA在各組中的表達(dá)Tab.3 Expression of E-cadherin andα-SMA in each group

3 討論

Patel等［18］在研究中發(fā)現(xiàn)60 mmol/L的葡萄糖能夠激活HK-2細(xì)胞的ROCK信號通路，并且Rho酶的激活是腎纖維化的誘因，證明高糖是誘導(dǎo)腎纖維化的原因。Rodrigues D等［15］研究發(fā)現(xiàn)鹽酸法舒地爾通過阻斷ROCK信號通路抑制血管緊張素Ⅱ引起的HK-2細(xì)胞纖維化。本研究采用高濃度葡萄糖建立糖尿病腎病模型，分別在動物及細(xì)胞水平對鹽酸法舒地爾關(guān)于糖尿病腎病的保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行研究，旨在為鹽酸法舒地爾在臨床藥物應(yīng)用方面提供指導(dǎo)。

本研究中，動物實驗結(jié)果顯示鹽酸法舒地爾實驗組的尿蛋白量以及血液中的尿素氮、肌酐含量都明顯低于糖尿病腎病模型組，這說明鹽酸法舒地爾對于糖尿病腎病造成的尿蛋白及血液中的尿素氮、肌酐含量升高有抑制作用，這與Massey［19］等研究結(jié)果一致。細(xì)胞實驗中，與未用高糖處理時(0 h)比較，高糖處理組(60 mmol/L)各個時間段檢測HK-2細(xì)胞Rho A活性均增高，此結(jié)果證明，在一定時間段內(nèi)，高濃度葡萄糖可以活化HK-2細(xì)胞Rho A分子。其原因可能為糖尿病患者腎細(xì)胞中存在Rho A的活化，并且高糖是活化Rho A的誘導(dǎo)因素。高糖組HK-2細(xì)胞內(nèi)上皮鈣粘素蛋白的表達(dá)量低于空白對照組，而高張組與空白對照組比較差異不具統(tǒng)計學(xué)意義，說明60 mmol/L的高濃度葡萄糖可以誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換，而高張不是誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的因素。該結(jié)果的發(fā)生是由于高糖分子通過活化RhoA而促使腎纖維化，導(dǎo)致HK-2細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換。鹽酸法舒地爾實驗組中上皮鈣粘素的表達(dá)量較高糖組高，α-SMA的表達(dá)量較高糖組低，表明法舒地爾能夠抑制由高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞肌成纖維細(xì)胞化。由于上皮鈣粘素、α-SMA是腎纖維化的2個標(biāo)志物，所以其升高與降低都可以反映腎纖維化與否。細(xì)胞實驗進(jìn)一步說明鹽酸法舒地爾對糖尿病腎病有保護(hù)作用，且該保護(hù)作用主要從抑制腎纖維化方面起效。

綜上所述，鹽酸法舒地爾對糖尿病腎病具有保護(hù)作用，通過抑制Rho/ROCK通路治療糖尿病性腎病方式是目前新型治療手段之一。

［1］Martynov SA，Shestakova MV，etal.Role of circulating angiogenic factors in diabetic kidney disease［J］.Vestn Ross Akad Med Nauk，2013，(2):35-42.

［2］Kuwabara T，Mori K，Mukoyama M，etal.Macrophage-mediated glucolipotoxicity via myeloid-related protein 8/toll-like receptor 4 signaling in diabetic nephropathy［J］.Clin Exp Nephrol，2013，19(3):433-442.

［3］Lin G，Brownsey RW，Macleod KM.Complex Regulation of PKCβ2 and PDK-1/AKT by ROCK2 in Diabetic Heart［J］.PLoS One，2014，9(1):e86520.

［4］Eringa EC，Bakker W，van Hinsbergh VW.Paracrine regulation of vascular tone，inflammation and insulin sensitivity by perivascular adipose tissue［J］.Vascul Pharmacol，2012，56(5-6):204-209.

［5］Xu J，Zou MH.Molecular insights and therapeutic targets for diabetic endothelial dysfunction［J］.Circulation，2009，120(13):1266-286.

［6］Shi J，Wei L.Rho kinases in cardiovascular physiology and pathophysiology:the effect of fasudil［J］.Cardiovasc Pharmacol，2013，62(4):341-354.

［7］Tondon A，Kaunas R.The direction of stretch-induced cell and stress fiber orientation depends on collagen matrix stress［J］.PLoS One，2014，9(2):e89592.

［8］Zhou H，F(xiàn)ang C，Zhang L，et a1.Fasudil hydrochloride hydrate，a Rhokinase inhibitor，ameliorates hepatic fibrosis in rats with type 2 diabetes［J］.Chin Med J(Engl)，2014，127(2):225-231.

［9］Peng F，Wu D，Gao B，et a1.RhoA/Rho—kinase contribute to thepatho—genesis of diabetic renal disease［J］.Diabetes，2012，57(6):1683-1692.

［10］Kikuchi Y，Yamada M，Imakiire T，et a1.A Rho—kinase inhibitor，fasudil，prevents development of diabetes and nephropathyin insulin—resistant diabeticrats［J］.JEndocrinol，2010，192(3):595-603.

［11］Kolavennu V，Zeng L，Peng H，et a1.Targeting of RhoA/ROCK signal in gameliorates progression of diabetic nephropathyin dependent of glucose control［J］.Diabetes，2010，57(3):714-723.

［12］Hayashi K，Wakino S，Kanda T，et a1.Molecular mechanisms and Therapeutic strategies of chronicrenal injury:role of rho—kinase in the development of renal injury［J］.J Pharmacol Sci，2012，100(1):29-33.

［13］Cheng HX，Yang XP，Zhao J.E—cadhefin and renal interstitial fibrosis［J］.JClin Exp Med，2010，15(9):1184-1187.

［14］Liao JK，Seto M，Noma K.Rhokinase(ROCK)inhibitors［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2011，50(1):17-24.

［15］Rodrigues DR，Carvajal GG，Sanchez LE，etal.Pharmacological modulation of epithelial mesenchymal transition caused by angiotensinⅡ.ROCK and MAPK pathways［J］.Pharm Res，2010，25(10):2447-2461.

［16］倪連松，高倩，顧玲佳.法舒地爾對高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的抑制作用［J］.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2012，26(1):30-34.

［17］Sterpetti P，Hack AA，Bashar MP，etal.Activation of the Lbc Rho exchange factor proto-oncogene by truncation of an extended C terminus that regulates transformation and targeting［J］.Mol Cell Biol，2009，19(5):1334-1345.

［18］Patel S，Takagi KI，Suzuki J，etal.Rho GTPase activation is a key step in renal epithelial mesenchymal transdifferentiation［J］.J Am Soc Nephrol，2010，16(7):1977-1984.

［19］Massey AR，Miao L，Smith BN，et a1.Increased RhoA translocation in renalcortex of diabeticrats［J］.Life Sci，2013，72(26):2943-2952.