蒽貝素對三氧化二砷抑制白血病干細胞生長的影響

張健

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 兒內科，河南 新鄉(xiāng) 4530000)

白血病是嚴重威脅人類生命健康的惡性腫瘤之一，是一類造血干細胞的惡性克隆性疾病。白血病干細胞(leukemia stem cells，LSCs)概念最早于1994年被提出，Dick等通過實驗證實了LSCs的存在。LSCs具有強大的自我更新能力，多向分化潛能，產生耐藥等特點［1］。LSCs被認為是導致白血病耐藥和復發(fā)的根源［2］。

三氧化二砷具有誘導腫瘤細胞分化、凋亡等作用，用于治療急性早幼粒細胞白血病取得了突出的療效，有學者認為三氧化二砷是通過降低磷酸甘露糖異構酶基因(phosphomannose isomerase，PMI基因)而靶向清除慢性粒細胞白血病患者體內的白血病干細胞［3］。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAPs)是近年來備受矚目的一類蛋白質家族，獨立于Bcl-2的抗凋亡蛋白。某些IAPs成員異常高表達常引起細胞凋亡受阻，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑。X連鎖凋亡抑制蛋白是腫瘤細胞內抑制凋亡發(fā)生的重要蛋白之一。蒽貝素是一種XIAP的小分子抑制劑，能夠通過抑制XIAP，進而誘導腫瘤細胞的凋亡［4-6］。本研究將蒽貝素與三氧化二砷聯(lián)合應用，考察XIAP的小分子抑制劑蒽貝素對三氧化二砷抑制白血病干細胞生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(美國熱電公司);流式細胞儀(美國貝克曼公司);DMEM高糖培養(yǎng)基(美國GIBCO公司);胎牛血清(美國康寧公司);蒽貝素(美國sigma公司);MTT試劑盒(sigma公司);注射用三氧化二砷(北京雙鷺藥業(yè));其余試劑為分析純。人急性髓細胞白血病細胞株(KG-1a，購自ATCC);非糖尿病型嚴重的聯(lián)合的免疫缺陷小鼠(成都達碩實驗動物公司，動物許可證號:2013069283)。

1.2 白血病干細胞培養(yǎng) 人急性髓細胞白血病細胞株KG-1a購自美國ATCC，表達CD34+CD19+CD38+/-的KG-1a白血病干細胞由南京凱基生物分離。將KG-1a白血病干細胞置于含有100mg/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2，飽和濕度，溫度為37℃。待細胞匯合度為0.8～0.9時，用2.5mg/L胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗，將白血病干細胞分為生理鹽水組、三氧化二砷組、蒽貝素組和三氧化二砷+蒽貝素組。

1.3 白血病干細胞增殖抑制實驗 培養(yǎng)KG-1a白血病干細胞接種于96孔板中，當孔板中細胞完全貼壁且處于對數(shù)生長期時加入無菌過濾后的生理鹽水、三氧化二砷注射液(1 mmol/mL)、蒽貝素溶液(40 mmol/mL)和三氧化二砷(1 mmol/mL)與蒽貝素(40 mmol/mL)混合溶液各20μL，使各孔終體積為200μL。每組設5組重復。將孔板移入37℃ CO2孵箱中分別培養(yǎng)24、48 h后取出，每孔加入20μL 5mg/mL MTT溶液，再放回孵箱中繼續(xù)孵育4 h，將孔板中液體倒出，每孔加入200μL DMSO，37℃避光振搖15 min，用熒光讀數(shù)儀在490 nm處測定各孔的光密度值。

1.4 白血病干細胞凋亡實驗 按“1.2”項下培養(yǎng)細胞并給藥，將KG-1a白血病干細胞給藥孵育24 h，然后用冰PBS清洗細胞3次，F(xiàn)ITC/PI雙染，細胞避光放置15 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡數(shù)量。

1.5 細胞劃痕實驗 細胞劃痕實驗(wound healing assay)用來在體外判斷腫瘤細胞的運動性和遷移能力。收集生長良好的KG-1a白血病干細胞，接種于12孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞生長融合率達到80%左右，用20μL移液槍頭垂直培養(yǎng)板機械性地劃出3條平行線，并用PBS洗滌細胞3次，保證劃痕處沒有細胞，補加完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。按照“1.2”項下給藥方法給藥，分別于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后，更換新鮮完全培養(yǎng)基，然后繼續(xù)培養(yǎng)18 h，考察劃痕兩側細胞間的距離和細胞遷移情況。

1.6 荷白血病小鼠模型動物實驗 參照Saprap等方法［7］將培養(yǎng)的KG-1a白血病干細胞通過尾靜脈注射入非糖尿病型嚴重的聯(lián)合的免疫缺陷小鼠體內，建模3 w后斷尾取血觀察小鼠外周血可見白血病細胞數(shù)目。取建模成功小鼠24只隨機分為4組，每組6只，分別為生理鹽水組、三氧化二砷注射液組(3mg/kg)、蒽貝素溶液組(120mg/kg)和三氧化二砷(3mg/kg)與蒽貝素(120mg/kg)混合溶液組。于分組后第3、6、9、12和15天給藥，觀察并記錄各組小鼠的生存期，繪制生存曲線。

2 結果

2.1 蒽貝素對三氧化二砷抑制白血病干細胞增殖的影響MTT實驗結果顯示，三氧化二砷和蒽貝素對KG-1a白血病干細胞均有一定的增殖抑制作用。當三氧化二砷與蒽貝素聯(lián)合用藥時，對KG-1a白血病干細胞的增殖具有更強的抑制作用，聯(lián)合用藥對白血病干細胞的抑制能力顯著強于單獨用藥，差異具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05，見圖1)。

圖1 不同藥物干預對KG-1a白血病干細胞存活率的影響*P＜0.05，與生理鹽水相比;#P＜0.05，與三氧化二砷和蒽貝素比較;ΔP＜0.05，與24 h的三氧化二砷+蒽貝素比較Fig.1 Effect of various drugs on KG-1a cell viability*P＜0.05，compared with control group;#P＜0.05，compared with As2 O3 or embelin;ΔP＜0.05，compared with As2O3+embelin at 24 h

2.2 蒽貝素對三氧化二砷促進白血病干細胞凋亡的影響研究藥物體外誘導KG-1a白血病干細胞凋亡的定量實驗結果表明，三氧化二砷、蒽貝素和聯(lián)合給藥都能不同程度誘導白血病干細胞的凋亡。各組誘導白血病干細胞壞死和早期凋亡率分別為36.96%、35.1%和94.1%，而對照生理鹽水組早期凋亡率為0.24%(見圖2)。

圖2 各給藥組對白血病干細胞凋亡的影響A:生理鹽水組;B:三氧化二砷組;C:蒽貝素組;D:聯(lián)合用藥組Fig.2 Effect of various drugs on KG-1a leukemia stem cells apoptosisA:saline group;B:As2 O3 group;C:embelin group;D:As2 O3+embelin group

2.3 蒽貝素聯(lián)合三氧化二砷對細胞遷移的影響 細胞劃痕實驗結果如圖3所示:生理鹽水組，三氧化二砷干預組和蒽貝素干預組的細胞均向中間劃痕區(qū)域生長，即細胞向“傷口”內運動遷移。而聯(lián)合干預組處理后的細胞這種現(xiàn)象減弱很多，僅有少數(shù)的細胞向劃痕中央遷移，但是比各單獨給藥組和生理鹽水組要少很多。結果說明，三氧化二砷和蒽貝素聯(lián)合干預能夠有效抑制KG-1a白血病干細胞的“傷口愈合”，從而影響KG-1a白血病干細胞的遷移性。

圖3 各給藥組對KG-1a白血病干細胞遷移能力的影響Fig.3 Effect of various drugs on KG-1a leukemia stem cells motility and migration

2.4 蒽貝素聯(lián)合三氧化二砷對荷瘤鼠中位生存期的影響荷瘤小鼠給藥第5次后停止給藥，直至小鼠全部自然死亡，統(tǒng)計各組小鼠的生存期，繪制Kplan-Meier曲線(見圖4)。結果顯示:生理鹽水組，蒽貝素組，三氧化二砷組和聯(lián)合給藥組的中位生存期分別為23、26、31和37d，聯(lián)合給藥能夠顯著延長荷瘤小鼠的生存期。

圖4 各組荷瘤小鼠的kaplan-meier曲線1.生理鹽水組;2.蒽貝素組;3.三氧化二砷組;4.三氧化二砷組+蒽貝素組Fig.4 kaplan-meier curves of tumor rats after treated with different drugs1.saline group;2.embelin group;3.As2 O3 group;4.As2 O3+embelin group

3 討論

造血干細胞是最早被證實存在的干細胞，而“腫瘤干細胞”這一概念最早被應用于白血病。學術界廣泛認為腫瘤干細胞是腫瘤耐藥、復發(fā)的根源［2］。目前針對白血病干細胞的治療策略包括抑制干細胞的信號通路分子、誘導干細胞凋亡、改變腫瘤微環(huán)境相關分子等［8-9］。

2010年，香港大學醫(yī)學院發(fā)現(xiàn)，若劑量適當，砒霜的潛在毒性會被解除，尤其是對心臟的副作用會大大減低，并成功把砒霜研發(fā)成為處方的口服藥物，已治愈超過一百名血癌病人?；颊呓邮艽隧椫委煹拇婊盥蔬_七成［10-11］。口服砒霜還能應用于治療其他癌癥，包括淋巴癌和多發(fā)性骨髓瘤。目前國內外的研究者們對三氧化二砷的抗腫瘤機制進行了廣泛而深入的研究，己證實三氧化二砷不僅對血液系統(tǒng)腫瘤有效，其對實體瘤如乳癌、肺癌、膀胱癌、神經母細胞瘤、頭頸部腫瘤、食管癌、胃癌、肝癌的生長和增殖均有抑制作用［12-14］。蒽貝素是一種XIAP的小分子抑制劑，能夠通過抑制XIAP，進而誘導腫瘤細胞凋亡。蒽貝素與其他化療藥物聯(lián)用能夠有效增強化療藥物對腫瘤細胞的抑制效果［15］。

本研究將三氧化二砷與蒽貝素聯(lián)合用于白血病干細胞的治療研究。研究結果表明，三氧化二砷聯(lián)合蒽貝素能夠有效抑制KG-1a白血病干細胞的增殖，蒽貝素能夠促進三氧化二砷誘導KG-1a白血病干細胞凋亡。腫瘤干細胞具有強大的自我更新能力和多向分化潛能。本研究通過細胞劃痕實驗考察給藥后腫瘤細胞的遷移能力。遷移是腫瘤細胞轉移過程中的一個重要環(huán)節(jié)。遷移就是腫瘤細胞與母體瘤分離，穿越血管壁，侵襲周邊正常組織時，需要一定的運動能力。結果顯示出聯(lián)合用藥能夠有效抑制白血病干細胞的遷移。體內荷瘤鼠治療實驗結果顯示，與對照組生理鹽水和各單獨給藥組相比，聯(lián)合給藥都能夠有效延長荷瘤小鼠的中位生存期。

綜上所述，蒽貝素能夠有效增強三氧化二砷對白血病干細胞的增殖抑制作用，誘導白血病干細胞凋亡，其機制與蒽貝素的抑制劑XIAP有關。三氧化二砷與蒽貝素聯(lián)合應用是一種潛在的抗腫瘤干細胞治療方法。

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