川芎嗪對原發(fā)性痛經(jīng)大鼠模型血液及組織中VEGF及其受體的影響

段成英，楊中東，趙嫣紅，武曉泓

(1.山東科技大學(xué)校醫(yī)院 藥房，山東 青島 266590;2.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇 南京 210029)

原發(fā)性痛經(jīng)(primary dysmenorrhoea，PD)又稱功能性痛經(jīng)，是年輕女性較為常見的病癥性痛經(jīng)，其癥狀并不伴有明顯的盆腔器質(zhì)性疾病，但常呈現(xiàn)下腹部痙攣性陣痛和其他常見癥狀包括頭痛乏力、頭暈、惡心嘔吐、腹瀉、腰腿痛［1］。

川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是傘形科植物川芎Rhizoma Chuanxiong的一種活性生物堿——四甲基吡嗪。該藥具有抗血栓形成、改善微循環(huán)、抗氧化、拮抗鈣離子及抗纖維化等作用，現(xiàn)已在臨床上用于治療多種疾?。?］。而有關(guān)鹽酸川芎嗪治療原發(fā)性痛經(jīng)性疾病的相關(guān)研究并不多。因此，本文旨在探究川芎嗪是否可以用于治療原發(fā)性痛經(jīng)性疾病及其可能的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:昆明種SD大鼠，體質(zhì)量160～180 g，雄性，由安徽長臨河醫(yī)藥科技有限公司提供，許可證號:SYXK(皖)2007—003。本動物實驗遵循《實驗動物保護(hù)條例》。

1.1.2 藥品:注射用鹽酸川芎嗪(鄭州卓峰制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20055479);田七痛經(jīng)膠囊(云南白藥集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z53021392);縮宮素針劑(天津市生物化學(xué)制藥廠生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H12020487);苯甲酸雌二醇注射液(廣州白云山明興制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H44022008)。

1.1.3 儀器:722分光光度計(上海第二分析儀器廠);F1－2021型C－放射免疫計數(shù)器(美國 Bio－Tek公司);LDZ5－2型離心機(jī)(黑馬儀器公司);低溫高速離心機(jī)(德國EPPENDORF公司);ELX800uv型酶標(biāo)儀(美國 Bio－Tek公司);LD4－8型低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組與造模:雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為4組:正常對照組，模型組，鹽酸川芎嗪注射液組，田七痛經(jīng)組，每組10只。除正常對照組外，其余各組大鼠連續(xù)皮下注射己烯雌酚10 d((第1天、第10天皮下注射，0.8mg/只;第2～9天注射，0.4mg/只)。

1.2.2 給藥方法:在注射己烯雌酚的第4天開始給藥，田七痛經(jīng)膠囊組按2 g/kg劑量灌胃，鹽酸川芎嗪注射液20mg/kg，痛經(jīng)模型組灌胃等體積的蒸餾水。

1.2.3 指標(biāo)檢測:①給藥28 d后，末次給藥45 min結(jié)束后，腹腔注射縮宮素0.2 U/只，觀察40 min內(nèi)各組動物扭體反應(yīng)次數(shù)及扭體反應(yīng)發(fā)生率，發(fā)生率=扭體動物數(shù)/試驗動物數(shù)×100%。

②給藥結(jié)束后，末次給予縮宮素后1.5 h，大鼠腹腔注射20%烏拉坦(3.0mL/kg)麻醉，腹主動脈取血8mL，其中4mL制備血清，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、NO 和免疫比濁法檢測超敏 C 反應(yīng)蛋白(hypersensitive C－reactive protein，hs－CRP)含量。另外4mL制備血漿，通過6－酮前列腺素F1a(6－ketoprostaglandin F1a，6－keto－PGF1a)免疫分析藥盒測定6－keto－PGF1a的含量。

③取血后剝離子宮，加入IP裂解液(含PMSF)研磨子宮組織，冰上裂解30 min，12 000 r/min，4℃離心10 min，取上清。收集組織蛋白，BCA法定量。Western blot檢測子宮組織中VEGFR－3蛋白表達(dá)。步驟如下:制備10%SDS－PAGE，蛋白上樣電泳;采用NC膜進(jìn)行濕轉(zhuǎn);BSA室溫封閉2h;VEGFR－2單抗(鼠抗羊，1∶1 000)一抗4℃孵育過夜;TBST洗膜3次，每次10 min;加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h;TBS洗膜3次，每次10 min;采用發(fā)光試劑盒ECL反應(yīng)，曝光、顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，正態(tài)計量數(shù)據(jù)用“±s”表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗和單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 鹽酸川芎嗪注射液對大鼠子宮收縮的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠40 min內(nèi)扭體反應(yīng)次數(shù)和扭體反應(yīng)發(fā)生率明顯增高(P＜0.01)。與模型組相比，川芎嗪注射液組可顯著地降低大鼠扭體反應(yīng)次數(shù)(P＜0.01)和扭體反應(yīng)發(fā)生率(P＜0.05，見表1)。

表1 鹽酸川芎嗪注射液對子宮收縮的相關(guān)影響Tab.1 Effect of tetramethylpyrazine injection on uterine contraction

2.2 鹽酸川芎嗪注射液對痛經(jīng)大鼠血液相關(guān)指標(biāo)的影響與正常對照組比較，模型組大鼠血清中VEGF、hs－CRP含量明顯增高(P＜0.05)，而鹽酸川芎嗪注射液可顯著減少血清中VEGF、hs－CRP的含量(P＜0.05)。與正常對照組相比，模型組大鼠血清中NO含量顯著減少(P＜0.05)。而與模型組相比，鹽酸川芎嗪注射液組的NO含量顯著升高(P＜0.05)。與正常對照組相比，模型組6－keto－PGF1a含量顯著性降低(P＜0.05)，而川芎嗪注射液可顯著升高 6－keto－PGF1a含量(P＜0.05，見表2)。

表2 鹽酸川芎嗪注射液對對痛經(jīng)大鼠血液相關(guān)指標(biāo)的影響Tab.2 Effect of tetramethylpyrazine injection on dysmenorrhea rats of blood indicators

2.3 鹽酸川芎嗪注射液對痛經(jīng)大鼠子宮組織中VEGFR－2蛋白表達(dá)水平的影響 Western blot結(jié)果顯示:與正常組相比，模型組大鼠子宮中VEGFR－2蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)，而鹽酸川芎嗪給藥組可顯著減少痛經(jīng)大鼠中VEGFR－2的蛋白的表達(dá)量(P＜0.05，見圖1)。

圖1 鹽酸川芎嗪注射液對大鼠子宮中VEGFR－2蛋白表達(dá)的影響1.正常對照組;2.模型組;3.鹽酸川芎嗪注射液組;4.田七痛經(jīng)組##P＜0.01，與正常對照組比較，＊＊P＜0.01，與模型組比較Fig.1 Effect of tetramethylpyrazine injection on VEGFR－2 protein expression of rat uterus##P＜0.01，compared with normal control group，＊＊P＜0.01，compared with model group

3 討論

VEGF是一種作用很強(qiáng)的促血管生成因子，對內(nèi)皮基質(zhì)的增殖和血管生成有著極為重要的作用。研究表明，VEGF在腫瘤血管生成及生理條件下血管生成中起著重要的調(diào)控作用［4］。最近研究表明，原發(fā)性痛經(jīng)的子宮內(nèi)膜中VEGFR－2表達(dá)顯著高于正常內(nèi)膜的表達(dá)量［5］。因此，本文檢測了原發(fā)性痛經(jīng)大鼠血清中VEGF的含量及其子宮中VEGFR－2蛋白的表達(dá)，旨在探究鹽酸川芎嗪注射液對原發(fā)性痛經(jīng)大鼠的血清中VEGF含量及其子宮中VEGFR－2蛋白表達(dá)的影響。研究結(jié)果表明:與正常對照組大鼠相比，原發(fā)性痛經(jīng)大鼠血清中VEGF含量明顯升高，而鹽酸川芎嗪注射液組可顯著減少大鼠血清中VEGF含量。同時，模型組大鼠可顯著上調(diào)VEGFR－2受體蛋白的表達(dá)，而鹽酸川芎嗪注射液可顯著下調(diào)VEGFR－2蛋白的表達(dá)。說明川芎嗪可能通過減少血清中VEGF的含量下調(diào)VEGFR－2蛋白的表達(dá)，減少子宮內(nèi)皮血管的形成，從而減緩PD的發(fā)病癥狀。

內(nèi)源性NO在調(diào)控血管張力中發(fā)揮著重要作用，其調(diào)控血管的作用機(jī)制與其提高細(xì)胞中鳥苷酸環(huán)化酶(guanylate cyclase，GC)的活性有關(guān)，通過提高細(xì)胞內(nèi)cGMP表達(dá)水平，最終誘導(dǎo)血管舒張［6］。除調(diào)節(jié)血管張力外，研究表明，內(nèi)源性NO的含量和合成與痛經(jīng)患者的發(fā)病有密切關(guān)系，痛經(jīng)患者內(nèi)源性NO含量顯著性減少后，會導(dǎo)致與其相關(guān)的生物信息傳遞功能發(fā)生異常，從而誘發(fā)痛經(jīng)癥狀［7］。本研究結(jié)果表明，原發(fā)性痛經(jīng)大鼠血清中NO含量較正常對照組顯著性降低，而鹽酸川芎嗪注射液可顯著提高血清NO含量。說明鹽酸川芎嗪注射液可通過升高NO含量，解除平滑肌痙攣，減緩原發(fā)性痛經(jīng)癥狀。

hs－CRP是血漿中的一種C反應(yīng)蛋白。C反應(yīng)蛋白是一種全身性典型炎癥反應(yīng)蛋白，是急性期的非特異性標(biāo)志物。血清hs－CRP具有激活補(bǔ)體、促進(jìn)吞噬細(xì)胞的活性、刺激單核細(xì)胞表面和其他免疫調(diào)控功能［8－9］。最新相關(guān)研究表明，原發(fā)性痛經(jīng)會導(dǎo)致血清中hs－CRP含量顯著上升。因此，本文檢測了大鼠血清hs－CRP含量，結(jié)果表明:原發(fā)性痛經(jīng)性大鼠血清中 hs－CRP含量明顯高于正常對照組，而鹽酸川芎嗪注射液可顯著減少血清中hs－CRP水平。說明鹽酸川芎嗪可通過阻止hs－CRP誘發(fā)的級聯(lián)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)炎癥部位的修復(fù)，發(fā)揮其抗炎鎮(zhèn)痛的藥理作用。

原發(fā)性痛經(jīng)主要的發(fā)病機(jī)制之一是前列腺素(PG)水平的升高，前列腺素主要包括前列腺素E2(PGE2)、前列腺素F2a(PGF2a)等。其中，6－酮前列腺素F1a(6－K－PGF1a)的主要來源是通過血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，其作用機(jī)制是促進(jìn)腺苷酸環(huán)氧化酶的活性，增加血小板內(nèi)源性cAMP的含量，抑制血小板的聚集，擴(kuò)張微血管，增加血流量［10］。本研究結(jié)果表明:模型組大鼠血清中6－K－PGF1a的含量明顯下降，而鹽酸川芎嗪給藥組可顯著增加6－KPGF1a的含量。表明鹽酸川芎嗪注射液可通過增加血清中6－KPGF1a含量，擴(kuò)張子宮血管，促進(jìn)微循環(huán)，發(fā)揮鎮(zhèn)痛緩解的藥理作用。

綜上所述，鹽酸川芎嗪注射液可顯著減少子宮收縮導(dǎo)致的扭體次數(shù)，減少扭體頻率。其可能作用機(jī)制是增加痛經(jīng)大鼠血清中VEGF和hs－CRP含量，減少NO的血清濃度及增加血漿中6－keto－PGF1a含量，發(fā)揮其抗炎鎮(zhèn)痛的作用。

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