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    RGD功能化多肽納米纖維的制備及其體內(nèi)腫瘤靶向性研究

    2014-11-17 08:31:36楊翠紅張玉民劉金劍劉鑒峰吳紅英褚麗萍
    中國生化藥物雜志 2014年5期
    關鍵詞:多肽放射性靶向

    楊翠紅,張玉民,劉金劍,劉鑒峰,吳紅英,褚麗萍

    (北京協(xié)和醫(yī)學院&中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所 實驗核醫(yī)學室,天津市放射醫(yī)學與分子核醫(yī)學重點實驗室,天津 300192)

    從20世紀90年代,自組裝多肽由于其組成為氨基酸,具有合成簡單、生物相容性好、易于進行功能基團的修飾,且可以根據(jù)需要自下而上地設計其序列組成,被廣泛應用于組織工程、藥物傳輸和再生醫(yī)學等領域[1-3]。由多肽自組裝形成的仿生納米材料其三維結構可以是球形,囊泡結構,片層結構,納米管和納米纖維等。其中,由多肽自組裝形成的納米纖維已廣泛用于三維細胞培養(yǎng),修復與再生醫(yī)學以及組織工程研究中[4]。

    短肽序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-aspartic acid,RGD)是整合素αvβ3的結合基序。整合素αvβ3具有在正常細胞、成熟血管內(nèi)皮細胞表面低表達,而在腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞表面和部分腫瘤細胞表面呈高水平表達的特性,這使其成為腫瘤新生血管顯像及靶向治療的主要靶點[5-8]。

    本文旨在通過多肽固相合成技術合成RGD功能化的自組裝多肽Nap-GFFYGRGD和非靶向的對照多肽Nap-GFFYGRGE,采用放射性同位素125I標記技術對多肽分子的體內(nèi)分布以及腫瘤靶向性進行系統(tǒng)研究,以期為抗腫瘤藥物載體提供數(shù)據(jù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 材料與試劑:BALB/c小鼠,雌性,平均體質量(20±0.5)g,購自北京軍事醫(yī)學科學院[許可證號:SCXK-(軍)2007-004],所有動物實驗均遵循《實驗動物保護條例》。多肽合成用氨基酸和有機試劑均購自天津凱通化學試劑有限公司;電鏡銅網(wǎng)、醋酸雙氧鈾購自北京中鏡科儀技術有限公司;Na125I(放射性比活度為12.95 GBq/mL)購自美國PE公司;氯胺-T,偏重亞硫酸鈉購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司。

    1.1.2 主要儀器:全自動 γ計數(shù)儀(2470 WIZARD2,PerkinElmer,美國);質譜儀(Finnigan LCQ AD,Thermo,美國);1H核磁共振(VARIAN Unity Plus 400 MHZ,Varian Instruments,美國);高效液相色譜(HPLC,綠綿科技有限公司,北京);透射電子顯微鏡(Tecnai G2 F20 系統(tǒng),F(xiàn)EI,美國)。

    1.2 方法

    1.2.1 多肽合成及表征:利用2-氯三苯甲基氯樹脂通過固相多肽合成方法制備Nap-GFFYGRGD和Nap-GFFYGRGE,具體合成方法參考徐宏艷等[9]。得到的粗產(chǎn)品使用反相高效液相色譜進行分離提純,分離柱采用C18,流動相為甲醇(含0.05%三氟乙酸)和水(含0.05%三氟乙酸)。通過核磁共振和高分辨率質譜對多肽分子結構進行表征。

    1.2.2 多肽自組裝與形貌觀察:用PBS溶液(0.01M,pH7.4)制備濃度為3mg/mL的RGD-肽和RGE-肽溶液,通過加入適量1M的NaCO3溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4。將多肽溶液于玻璃小瓶中加熱至沸騰,自然冷卻至室溫,靜置2 h即得到穩(wěn)定的RGD-纖維和RGE-纖維溶液。分別取多肽纖維溶液10μL至銅網(wǎng)上,用飽和醋酸雙氧鈾染液染色5s,用超純水洗1次后置于干燥器中過夜,用于透射電鏡觀察。

    1.2.3 多肽125I標記及純化:采用氯胺-T法對多肽進行放射性同位素125I標記。配制2mg/mL的多肽溶液,向500μL多肽溶液中加入0.5 mCi Na125I和500μL氯胺-T溶液(1mg/mL),室溫震蕩反應2 min,再加入500μL偏亞硫酸鹽鈉溶液(0.2mg/mL)用以終止反應。標記多肽通過放射性HPLC進行分離純化,流動相為乙腈和甲醇。

    1.2.4 腫瘤模型的制備:選取4~5周雌性的BALB/c小鼠,前肢腋下注射小鼠乳腺癌細胞系4T1細胞懸液100μL(4×105細胞),SPF級環(huán)境中飼養(yǎng),2周后篩選腫瘤體積約為200 mm3的小鼠用于實驗。

    1.2.5 組織分布:將荷瘤BALB/c小鼠隨機分為125I-RGD-纖維組和125I-RGE-纖維組,每組12只;共分4個時間點取材,每個時間點 3只。將125I-RGD-纖維和125I-RGE-纖維溶液按2.0×104Bq/g劑量經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi),注射后1、3、6、12 h進行取材;具體操作為:摘眼球取血,將小鼠脫頸處死后取腫瘤組織和心、肝、脾、肺、腎、胃、大腸、小腸、肌肉和腦等器官,稱重后利用γ計數(shù)儀檢測各樣品中的放射性活度,計算放射性攝取率——以每克組織放射性占注射量的百分比(%ID/g)表示。

    1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 19.0進行分析,正態(tài)計量數(shù)據(jù)采用“±s”表示,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 多肽的分子結構及其自組裝微觀形貌 RGD多肽和RGE多肽的分子結構式見圖1。透射電鏡結果表明3mg/mL的RGD-肽和RGE-肽溶液自組裝后的微觀形貌均為納米纖維,直徑約為10~20 nm(見圖2)。

    圖1 多肽分子Nap-GFFYGRGD(A)和Nap-GFFYGRGE(B)結構式Fig.1 Molecular structures of Nap-GFFYGRGD(A)and Nap-GFFYGRGE(B)

    圖2 多肽自組裝納米纖維RGD-纖維(A)和RGE-纖維(B)的透射電鏡圖Fig.2 TEM images of RGD-fiber(A)and RGE-fiber(B)

    2.2 多肽125I標記及其純化 為了研究多肽的體內(nèi)分布情況,通過氯胺-T法對多肽序列中的酪氨酸(羥基苯環(huán)的鄰位上)進行放射性同位素125I標記,利用放射性HPLC進行分離純化。放射性HPLC圖譜結果顯示多肽的標記率約為70.3%(見圖3)。純化后可以用于后續(xù)體內(nèi)分布實驗。

    圖3 125 I標記多肽的放射性HPLC圖譜A:放射性信號通道;B:HPLC 214 nm通道最左邊峰為游離同位素125 I峰;中間峰為未標記多肽峰;右峰為125 I標記多肽峰Fig.3 The Radioactive HPLC images of iodine-125 labeled peptidesA:radioactive channel;B:HPLC channel of 214 nm peaks from left to right was free 125 I,non-labelled peptide and 125 I-labelled peptide

    2.3 組織分布 2種納米纖維的體內(nèi)分布結果見圖4,由圖4A和4B可以看出RGD纖維和RGE纖維在組織中的分布規(guī)律相似,均在胃中分布最高,且在注射后1 h分布最高,分別為33.1%ID/g和35.5%ID/g,其次為大腸、小腸和血液,且隨著時間的延長逐漸被清除體外。值得注意的是,2者在腫瘤組織中的分布有差異。如圖4C所示,在注射后1~6h期間,RGD纖維在腫瘤組織中的分布一直呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢,而RGE纖維從3 h開始降低,尤其是在6 h時RGD纖維的腫瘤蓄積量是RGE纖維的2.2倍(分別為6.25%ID/g和2.79%ID/g),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

    圖4 125 I標記多肽納米纖維的體內(nèi)分布結果A:RGD-纖維的組織分布結果;B:RGE-纖維的組織分布結果;C:RGD-纖維和RGE-纖維的腫瘤組織分布結果**P<0.01,與RGE-fiber相比Fig.4 The in vivo distribution of iodine-125 labeled peptide nanofibers after i.v.administrationA:RGD-fiber;B:RGE-fiber;C:the tumor accumulation**P<0.01,compared with RGE-fiber

    3 討論

    多肽自組裝形成的納米纖維在藥物傳輸領域是一個嶄新的研究方向,并且有非常好的應用前景[10]。Stupp課題組報道了由兩親性多肽分子自組裝形成的納米纖維可以作為疏水抗癌藥物喜樹堿的載體,并在小鼠體內(nèi)明顯抑制了腫瘤的生長[11]。本課題組之前研究發(fā)現(xiàn)多肽分子Nap-GFFYGRGD與疏水抗腫瘤藥物10-羥基喜樹堿共組裝形成的載藥納米纖維在體內(nèi)可明顯提高10-羥基喜樹堿的抑瘤效果[12]。

    三肽序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arginine-Glycine-Aspartic acid,RGD)是最為廣泛使用的腫瘤靶向短肽,已用于治療基因、藥物、脂質體、蛋白和顯像劑等的腫瘤靶向傳輸[13-14]。RGD基序可以通過多肽固相合成技術在多肽合成過程中直接共價結合到自組裝多肽的外層親水序列中,合理地設計自組裝多肽序列可以得到含活性RGD靶向基團的納米結構。Zheng等[15]通過Nap-FFGRGD分子在疏水血管材料表面自組裝得到了RGD功能化血管,原位移植后提高了兔頸動脈的血管再生和整合能力。

    以上文獻報道以及本課題組前期的研究結果都表明:自組裝多肽納米纖維用于藥物載體在細胞及動物水平上均具有較好的治療效果,但是尚無文獻報道直接研究此類載體材料經(jīng)尾靜脈注射后的體內(nèi)分布情況,尤其是腫瘤組織靶向情況。放射性同位素示蹤技術是利用放射性核素作為示蹤劑對化合物進行標記,通過對放射性信號的檢測研究化合物最終去向的方法,可以實現(xiàn)在分子水平、細胞水平、組織乃至全身水平上的化合物定量示蹤研究。因其具有示蹤靈敏度高、定位準確等優(yōu)點已經(jīng)被大量應用于生物學、醫(yī)學研究及臨床診斷中[16]。

    本研究通過合成含有腫瘤靶向基團RGD的多肽,并以125I為示蹤劑對多肽進行標記,自組裝后形成納米纖維,經(jīng)尾靜脈注射后研究靶向多肽纖維的體內(nèi)分布及腫瘤組織蓄積情況。實驗結果表明RGD-纖維與陰性對照RGE-纖維相比在體內(nèi)腫瘤部位的分布明顯增加,顯示出明顯的體內(nèi)腫瘤靶向作用,為其作為藥物載體的體內(nèi)及臨床應用提供了理論依據(jù)。

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