組織蛋白質(zhì)組學(xué)在動脈粥樣硬化疾病中的研究進展

張光偉+++劉恩岐

[摘要] 動脈粥樣硬化是一種高致殘率和致死率的疾病之一。其分子機制的初步探明已經(jīng)為疾病的預(yù)防、診斷和康復(fù)檢測提供一些重要的信息，但更深層次的機制未明。該研究概述了近年來蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，動物模型中動脈粥樣硬化組織蛋白質(zhì)組學(xué)以及人類的動脈粥樣硬化組織蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進展，并就動脈粥樣硬化組織蛋白組學(xué)存在的問題以及發(fā)展方向作了探討。

[關(guān)鍵詞] 動脈粥樣硬化；機制；組織；蛋白質(zhì)組學(xué)

[中圖分類號] R543 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2014）06（c）-0195-02

動脈粥樣硬化是血管壁廣泛病變的疾病，從血管壁的輕度增厚、血管管腔的狹窄、冠狀動脈閉塞到最終的心肌梗死。在發(fā)展中以及發(fā)達(dá)國家，該疾病是一種其分子機制的初步探明已經(jīng)為臨床的預(yù)防、診斷和康復(fù)檢測提供一些重要的信息，但更深層次的機制未明。由于蛋白質(zhì)在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，蛋白質(zhì)組學(xué)為進一步的探討疾病機制提供了一種較理想的方法學(xué)。當(dāng)前，動脈粥樣硬化的蛋白質(zhì)學(xué)研究主要集中在血清生物學(xué)標(biāo)記的研究，然而組織蛋白質(zhì)組學(xué)卻可以深層次研究細(xì)胞因子的分泌、動脈壁或細(xì)胞。該綜述報道了動脈粥樣硬化的組織蛋白質(zhì)組學(xué)最新研究進展。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展

目前，蛋白質(zhì)組學(xué)的分析技術(shù)已經(jīng)歷了兩代，利用2DE為第一代蛋白分離技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)；在質(zhì)譜中的ESI發(fā)展和最新進展提供了第二代蛋白質(zhì)組學(xué)的方法學(xué)，該技術(shù)主要以高相液相色譜為基礎(chǔ)，稱為Shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)或MudPIT。雖然經(jīng)典的蛋白質(zhì)組學(xué)方法部分被Shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)取代，但粥樣斑塊蛋白質(zhì)組學(xué)的研究原則上還是主要依靠2DE分析。另外，其他的方法還有LC-MS/MS、抗體或印跡分析以及MS成像，最近組織微陣列（TMAs）是研究血管疾病蛋白表達(dá)的強有力的工具。

2 組織蛋白質(zhì)組學(xué)在動脈粥樣硬化的研究

2.1 動脈粥樣硬化動物模型的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

apoE缺陷小鼠是研究動脈粥樣硬化病理學(xué)最理想的動物模型。最近有兩項研究以apoE缺陷小鼠為模型，利用2DE分析主動脈的差異表達(dá)。第1項研究為不同主動脈損傷（輕度、中度、重度）的小鼠與野生型小鼠比較，分析蛋白差異表達(dá)。在銀染膠中鑒定出79個差異表達(dá)點，這些是缺陷小鼠動脈粥樣硬化早期出現(xiàn)的免疫活性、氧化應(yīng)激和能量損傷的蛋白質(zhì)。特別是，抗氧化酶蛋白1-Cys只在野生型小鼠主動脈組織中發(fā)現(xiàn)，而氧化形式在apoE缺陷小鼠中高表達(dá)。研究還顯示，谷胱甘肽還原酶和蘋果酸酶的增加與粥樣斑塊氧化應(yīng)激和抗氧化反應(yīng)一致。更為有趣的是，在apoE缺陷小鼠粥樣斑塊中出現(xiàn)免疫球蛋白的沉積[1]。第2項研究針對apoE缺陷TLR2部分缺陷或完全敲除的小鼠的主動脈進行經(jīng)典的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。報道顯示，TLR2+/+小鼠的斑塊內(nèi)單核細(xì)胞侵潤、凋亡、脂質(zhì)含量和前炎癥因子增加，平滑肌細(xì)胞減少。進一步確認(rèn)，免疫系統(tǒng)與引起動脈粥樣硬化進展的炎癥反應(yīng)的聯(lián)系，另外還說明了TLR2在此過程中作用。Sypro Ruby膠的差異分析，7種代表氧化應(yīng)激適應(yīng)性反應(yīng)的蛋白（順烏頭酸酶、延胡索酸水合酶、凝溶膠蛋白、血紅蛋白、肌球蛋白輕鏈多肽3、SOD2和Vesl-2）在TLR2+/+小鼠的斑塊高表達(dá)[2]。Almofti等利用高膽固醇飲食和維生素D3注射誘導(dǎo)大鼠動脈粥樣硬化模型，研究主動脈差異蛋白表達(dá)，通過Colloidal Coomasie 2DE膠和質(zhì)譜分析，鑒定出46個蛋白。18種在疾病組織中過表達(dá)，包括一系列氧化過程中的酶如抗氧化酶2、NADH脫氫酶、Fe-S；28種下調(diào)蛋白，包括CaM-kⅢ、轉(zhuǎn)移酶、果糖雙磷酸醛縮酶。任何一個驗證試驗都認(rèn)為這些蛋白參與動脈粥樣硬化過程[3]。外科學(xué)方法誘導(dǎo)的頸動脈狹窄大鼠模型，進行轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)研究，利用2DE和銀染鑒定出16個表達(dá)差異點，其中5個為2到3個蛋白的復(fù)合體。最終鑒定19種蛋白，其中8種蛋白表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄水平一致。這些研究證實，轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以不必考慮翻譯和翻譯后蛋白水平的調(diào)控[4]。

2.2 人類動脈粥樣硬化標(biāo)本的研究

目前，人類粥樣斑塊蛋白質(zhì)組學(xué)的研究比動物模型更廣泛。不同的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相繼被應(yīng)用，從Shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)或2DE到抗體陣列和質(zhì)譜成像。用于研究的斑塊標(biāo)本大部分來自頸動脈組織活檢。

3種經(jīng)典的頸動脈組織提取物的蛋白質(zhì)組學(xué)從2005相繼報道[5-7]。含血栓的頸動脈斑塊和穩(wěn)定性斑塊比較，進行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，結(jié)果在含血栓的斑塊中α1-抗胰蛋白酶表達(dá)上調(diào)。該結(jié)果最終通過1DE和2DE的免疫印跡驗證。α1-抗胰蛋白酶在炎癥條件下，由肝臟表達(dá)，能夠抑制膠原蛋白酶和彈性蛋白酶活性，可能提高斑塊的纖維化[5]。Part等利用2DE對頸動脈動脈粥樣硬化斑塊核心區(qū)和周圍正常區(qū)組織進行蛋白質(zhì)組學(xué)研究。21種差異蛋白被鑒定出，其中hsp27被驗證并進行進一步的分析[6]。該蛋白是第一個在頸動脈斑塊分泌研究中發(fā)現(xiàn)的具有潛在的動脈粥樣硬化生物標(biāo)記物[8]。Part等研究發(fā)現(xiàn)hsp27在斑塊核心區(qū)含量周圍正常區(qū)下降。其他研究結(jié)果與以前的報道相反。免疫印跡顯示，正常組織hsp27表達(dá)水平較非動脈粥樣硬化區(qū)，血清hsp27在患者中也增加[6]。通過其他組的后續(xù)研究hsp27水平的下降與高損傷區(qū)的面積和斑塊的不穩(wěn)定性有關(guān)[7，9]。最新的2DE研究包括大量的被分為含穩(wěn)定性和非穩(wěn)定性斑塊頸動脈標(biāo)本，通過MALDI-TOF質(zhì)譜從膠中鑒別出大量差異點。差異表達(dá)分析結(jié)果顯示，在兩組中含有9種差異蛋白，包括上調(diào)蛋白：鐵蛋白輕鏈亞基、纖維蛋白原D、SOD2；下調(diào)蛋白：膜聯(lián)蛋白A1、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶P1-1、HSP20、HSP27、RhoGDI、SOD3。免疫印跡驗證了板塊中含有高水平的纖維蛋白原D，該蛋白的效應(yīng)為增加血管細(xì)胞內(nèi)皮通透性、分裂、前炎癥刺激、化學(xué)因子的釋放。Sung等建立以主動脈組織活檢為基礎(chǔ)的斑塊2DE。差異分析結(jié)果顯示，39差異點增加，僅有少數(shù)幾個點減少。過表達(dá)的蛋白利用MALDI-TOP MS進行鑒定，其中13在動脈粥樣斑塊組中所有膠的1或2中高表達(dá)，而其他14個在所有膠中高表達(dá)。3個高表達(dá)蛋白進行免疫印跡確認(rèn)，兩個蛋白在所用膠中上調(diào)，包括膜聯(lián)蛋白A5和誘捕受體；1個蛋白僅在1或2塊膠中高表達(dá)，該蛋白為14-3-3γ。該研究發(fā)現(xiàn)的下調(diào)蛋白可以作為疾病的生物學(xué)標(biāo)記物如hsp27[10]。endprint

抗體陣列技術(shù)在最近幾年獲得了長足的發(fā)展。該項技術(shù)利用玻片的抗體點樣與蛋白樣本共同孵育，定量比較蛋白質(zhì)表達(dá)水平，并進一步發(fā)展為化學(xué)發(fā)光技術(shù)。盡管該技術(shù)較簡便，但僅見一例關(guān)于粥樣斑塊提取物的抗體陣列研究。Slevin等用512份抗體設(shè)置陣列探討與穩(wěn)定性斑塊相比較不穩(wěn)定性斑塊蛋白水平的變化。共有21蛋白在穩(wěn)定性斑塊中高表達(dá)，3種蛋白水平在穩(wěn)定性斑塊增加。在不穩(wěn)定斑塊中過表達(dá)的蛋白有一些為以前研究確認(rèn)上調(diào)的蛋白如：TNFα、HIFIα、hsp40、CRP2。11種有關(guān)炎癥、血管生成、增殖和凋亡相關(guān)的蛋白通過免疫印跡和免疫組織化學(xué)進行確認(rèn)，TNFα和HIFIα作為內(nèi)參照。免疫印跡不僅對以上兩組進行驗證，另外加非動脈粥樣斑塊的頸動脈組。結(jié)果顯示，與非粥樣斑塊組相比，在斑塊（穩(wěn)定性和非穩(wěn)定性）所有11上調(diào)蛋白進一步確定8種蛋白，包括：TNFα、TRAF4、Gads、GIT1、Caspase-9、c-src、TOPOⅡ-α和JAM-1），免疫組化實驗利用不同的細(xì)胞標(biāo)志物蛋白抗體確定了在組織內(nèi)表達(dá)特定蛋白的細(xì)胞類型[11]。

Martinet等利用印跡陣列研究頸動脈斑塊和乳房動脈提取物的蛋白差異。他們使用了823份抗體分析信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，發(fā)現(xiàn)15種蛋白表達(dá)差異達(dá)5倍以上，但免疫印跡只確認(rèn)7種蛋白，提示該方法易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。盡管如此，有意義的蛋白在斑塊中下調(diào)，其中之一與apoE過表達(dá)一致。血栓蛋白-2、MnSOD、apo B100、PTP1C在頸動脈中上調(diào)；ALG-2和糖原合成酶-3β下調(diào)。ALG-2的表達(dá)通過免疫組化和RT-PCR分析。免疫組化結(jié)果顯示，該蛋白在乳房動脈和粥樣斑塊中低表達(dá)，提示通過該技術(shù)不能檢測該蛋白在兩種組織中的變化；RT-PCR也不能檢測到差異，提示蛋白的調(diào)控為轉(zhuǎn)錄后水平[12]。

迄今為止，所有的動脈粥樣硬化蛋白質(zhì)組學(xué)研究的標(biāo)本均為頸動脈或主動脈。雖然冠狀動脈血栓的發(fā)生是心血管死亡率的最大危險因素，但因其取材的困難，還沒廣泛用于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。第一個關(guān)于人類冠狀動脈的蛋白質(zhì)組學(xué)的報道為簡短報道，研究者利用健康和疾病的冠狀動脈進行2DE，并對膠銀染。結(jié)果顯示，鐵蛋白輕鏈在冠狀動脈中增加。免疫印跡確認(rèn)了該結(jié)果；RT-PCR顯示，鐵蛋白輕鏈mRNA水平在病變動脈中減少，說明該蛋白為轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控[13]。

最近，Bagnato等利用shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)研究冠狀動脈斑塊。該方法的對象為水解酶消化的組織，最后用MudPIT方法鑒定蛋白。直接蛋白質(zhì)組學(xué)可以有效的應(yīng)用冠狀動脈組織。從石蠟包埋組織可以鑒定225種蛋白，然而，從冰凍組織中卻可以鑒定出558種蛋白。而且他們對冠狀動脈血管壁層進行了激光分離，LC-MS/MS分析分離層，共鑒定出806種蛋白。免疫組化確認(rèn)了4種在動脈粥樣硬化疾病進展中發(fā)揮作用重要蛋白，這些蛋白在以前未見報道。研究者期望用該方法發(fā)現(xiàn)冠狀動脈提取物中生長因子和細(xì)胞因子，但由于濃度太低沒能如愿。因此，他們使用AQUA方法結(jié)合多反應(yīng)監(jiān)控技術(shù)最終檢測出傳統(tǒng)shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)無法鑒定出的4種蛋白，包括：TGFβ、bFGF、PDGFβ和SDF-1α，其中TGFβ和SDF-1α可以被有效檢測[14]。

3 小結(jié)與展望

伴隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展，研究者們從動物模型和人類所獲的動脈粥樣硬化組織標(biāo)本中，鑒定出了大量的差異蛋白。這些差異蛋白對探討疾病的機制具有重要作用。但是該研究仍存在一些問題需要解決。首先，嚴(yán)重心血管事件（如心肌梗死和腦卒中）的發(fā)生主要由于是動脈粥樣硬化斑塊破裂所形成的血栓導(dǎo)致的。由于斑塊破裂動物模型一直是研究動脈粥樣硬化的瓶頸，因此導(dǎo)致斑塊破裂的原因至今不明。若能夠提高和改進獲取破裂斑塊的人類標(biāo)本技術(shù)，并結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，將在對斑塊破裂機制的研究中起重要作用。其次，動脈粥樣硬化是一種涉及多種蛋白、細(xì)胞和組織異常的復(fù)雜疾病病理過程。盡管人們已經(jīng)利用分離動脈粥樣硬化斑塊組織進行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，然而這種組織分離技術(shù)還是不夠精細(xì)。更精細(xì)的組織分離技術(shù)結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)是研究動脈粥樣硬化機制的方向之一。另外，雖然人們已經(jīng)鑒定出動脈粥樣硬化差異蛋白，但是這些差異蛋白在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中是伴隨關(guān)系還是影響著疾病的進程，還需要做更深入的探討。最后，組織中個別蛋白豐度較低和研究方法學(xué)通量不大和靈敏度較低等問題也是該領(lǐng)域需要克服的瓶頸。

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（收稿日期：2014-03-29）endprint