1株產(chǎn)纖維素酶絲狀真菌產(chǎn)油工藝的優(yōu)化

摘要：以1株峽串脈孢霉為材料，利用玉米秸稈纖維素為主要碳源，以產(chǎn)油率為指標(biāo)，通過單因素及正交試驗方法優(yōu)化產(chǎn)油發(fā)酵工藝，發(fā)現(xiàn)最優(yōu)產(chǎn)脂發(fā)酵工藝為：碳源為2%纖維素+2%葡萄糖，氮源為硝酸銨，溫度為28 ℃，培養(yǎng)時間為5 d，初始pH值為4，C/N比為8 ∶1。氮源選擇具有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性，所做交互作用不明顯。

關(guān)鍵詞：絲狀真菌；產(chǎn)油工藝；正交試驗；纖維素酶；峽串脈孢霉

中圖分類號： Q939.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0316-02

收稿日期：2013-10-13

基金項目：忻州師范學(xué)院科研項目（編號：201005）。

作者簡介：張玲秀（1975—），男，山西定襄人，碩士，助教，主要從事資源微生物和應(yīng)用微生物研究。E-mail：twozeroxiu@126.com。纖維素類物質(zhì)是地球上分布最廣、含量最豐富的碳源物質(zhì)，是自然界中數(shù)量最大的可再生資源，纖維素的轉(zhuǎn)化利用對于解決目前世界能源危機(jī)、糧食短缺、環(huán)境污染等問題，具有十分重要的意義。通過菌種選育和發(fā)酵工藝等基礎(chǔ)研究，分離和篩選出針對不同行業(yè)的高效纖維素分解菌群，有望解決纖維素酶產(chǎn)量和活性都不高、成本偏高的問題[1]。最近，石油價格波動和國家能源安全的需求，促使全球發(fā)展可持續(xù)生物工藝替代傳統(tǒng)的石油加工，通過微生物代謝，生產(chǎn)下一代生物燃料，包括游離脂肪酸、長鏈脂肪醇和酯類、長鏈烯烴等。工程菌株可利用糖類來生產(chǎn)生物燃料，通過傳統(tǒng)的工藝優(yōu)化進(jìn)一步提高產(chǎn)量[2]。試驗所使用的絲狀真菌，不僅可高產(chǎn)纖維素酶（45.32 U），而且菌體可積累14.24%的油脂，具有一定的應(yīng)用價值和進(jìn)一步研究的必要性[3]。本試驗對該真菌產(chǎn)纖維素酶和胞內(nèi)產(chǎn)油脂的工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在篩選高效降解纖維素和產(chǎn)油脂菌株的基礎(chǔ)上，建立一種利用農(nóng)業(yè)秸稈生產(chǎn)微生物油脂的工藝。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗菌株所用菌株為忻州師范學(xué)院篩選獲得的1株峽串脈孢霉（Paepalopsis Kühn），該菌株的纖維素酶活和濾紙酶活均高于里氏木霉（Trichoderma reesei）[3]。

1.1.2培養(yǎng)基產(chǎn)脂發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米秸稈纖維素（CMC）2%，酵母膏0.3%，檸檬酸三鈉0.1%，硝酸鈉0.3%，K2HPO4 0.1%，KCl 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.015%，CaCl2、CuSO4、ZnSO4 均為0.004%，1×105 Pa滅菌30 min。

1.1.3主要儀器UV2550紫外可見光譜（日本島津）；SY-305B 發(fā)酵罐，由上海世遠(yuǎn)生物設(shè)備工程有限公司生產(chǎn)；YXQ-LS-50G 立式壓力蒸汽滅菌器，由上海博迅實驗有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)；天平，由梅特勒托利多儀器有限公司生產(chǎn)；THZ-98A恒溫振蕩器，由上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，由上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)。

1.2試驗方法

1.2.1油脂含量的測定菌種在PDA培養(yǎng)基試管斜面上 27 ℃ 培養(yǎng)活化3次后轉(zhuǎn)接到產(chǎn)脂發(fā)酵培養(yǎng)基中，再經(jīng)5 d振蕩培養(yǎng)，收集菌體，用水充分洗滌后80 ℃烘干，稱質(zhì)量。干菌體用氯仿-甲醇（體積比2 ∶1）混合溶劑在索氏抽提器中 80 ℃ 回流6 h，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓，去除溶劑得粗油脂，再用石油醚充分溶解粗油脂后，過濾去除雜質(zhì)，減壓蒸餾去除石油醚即得油脂，稱質(zhì)量。油脂質(zhì)量與干菌體質(zhì)量之比即為產(chǎn)油率[4]。

1.2.2單因素及正交優(yōu)化設(shè)計本試驗單因素優(yōu)化選取6個因素：纖維素濃度、氮源、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、初始pH值、C/N，以含油率為指標(biāo)，得到各因素最適水平。在單因素試驗的基礎(chǔ)上進(jìn)一步做L27（313）正交優(yōu)化試驗（表1、表2）。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果

2.1.1碳源對產(chǎn)油率的影響通過改變產(chǎn)脂發(fā)酵培養(yǎng)基中纖維素濃度和葡萄糖（Glu）的添加量，進(jìn)行最適碳源濃度的篩選。由圖1可知，隨著纖維素濃度升高，產(chǎn)油率不斷提高，當(dāng)增加到一定濃度時則產(chǎn)油率不再提高，2%纖維素+2%葡萄糖（Glu）為最適碳源，產(chǎn)油率為14.48%，這可能是因為碳源達(dá)到飽和后，將不再影響產(chǎn)油率。另外，一定量的葡萄糖將有助于提高產(chǎn)油率，這是因為葡萄糖作為可高效利用的碳源，有利于菌體的快速生長。

2.1.2氮源對產(chǎn)油率的影響以2%纖維素+2%的葡萄糖為碳源，分別選取酵母膏、蛋白胨、硫酸銨、硝酸鈉、硝酸銨為氮源，對最適氮源進(jìn)行篩選。由圖2可知，硝酸銨為最適氮源，產(chǎn)油率為30%，這可能與菌體積累油脂是在氮缺乏下進(jìn)行有關(guān)，與Gill等的研究結(jié)果[5]一致。

2.1.3培養(yǎng)溫度對產(chǎn)油率的影響分別采用20、24、28、32、36 ℃等不同培養(yǎng)溫度進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果（圖3）表明，28 ℃ 為最佳培養(yǎng)溫度，產(chǎn)油率為25.32%，這與絲狀真菌菌體最佳生長溫度相匹配。

2.1.4培養(yǎng)時間對產(chǎn)油率的影響由圖4可見，菌種 1～7 d

不斷培養(yǎng)過程中，產(chǎn)油率不斷變化；培養(yǎng)5 d產(chǎn)油率最高，達(dá)25.41%，為最適培養(yǎng)時間。這是因為菌體在不斷生長過程中，隨著外界培養(yǎng)條件的惡化，積累油脂量逐漸達(dá)到最大值。

2.1.5培養(yǎng)基初始pH值對產(chǎn)油率的影響分別配制初始pH值為2、4、6、8、10的液體培養(yǎng)基，碳源為2%纖維素+2%葡萄糖，氮源為硝酸銨，于28 ℃連續(xù)培養(yǎng)5 d后，離心沉淀菌絲體并提取油脂計算產(chǎn)油率。由圖5可見，在酸性培養(yǎng)條件下產(chǎn)油率較高，其中初始pH值為4時產(chǎn)油率最高，為24.46%。

2.1.6C/N比對產(chǎn)油率的影響以2%纖維素+2%葡萄糖作為碳源，液體培養(yǎng)基中加入C/N比為2 ∶1、4 ∶1、8 ∶1、12 ∶1、16 ∶1的硝酸銨溶液。由圖6可見，C/N比為8 ∶1時產(chǎn)油率最高，可達(dá)18.41%。endprint

2.2正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表2。用SPSS Statistics 20軟件分析各因素顯著性及交互作用，結(jié)果見表3。由表3可見，各因素對產(chǎn)油率影響大小依次為氮源>纖維素濃度>初始pH值>C/N比>培養(yǎng)溫度。其中，氮源在統(tǒng)計學(xué)上顯著（P<0.05），纖維素濃度在α=0.1水平上顯著，所做3項交互作用不顯著。

3小結(jié)

本試驗以高產(chǎn)纖維素酶的1株絲狀產(chǎn)油真菌為材料，利用農(nóng)業(yè)玉米秸稈纖維素為主要碳源，通過單因素及正交試驗方法優(yōu)化產(chǎn)油發(fā)酵工藝，發(fā)現(xiàn)最優(yōu)產(chǎn)油發(fā)酵工藝為：碳源為2%纖維素+2%葡萄糖，氮源為硝酸銨，溫度為28 ℃，培養(yǎng)時間為5 d，初始pH值為4，C/N比為8 ∶1，這為進(jìn)一步開發(fā)和利用農(nóng)業(yè)秸稈、生產(chǎn)微生物油脂提供了參考，具有一定的理論研究意義和實際應(yīng)用價值。

參考文獻(xiàn)：

[1]張傳富，顧文杰，彭科峰，等. 微生物纖維素酶的研究現(xiàn)狀[J]. 生物信息學(xué)，2007，5（1）：34-36.

[2]Perlack R D，Wright L L，Turhollow A F，et al.Biomass as feedstock for a bioenergy and bioproducts industry：the technical feasibility of a billionton annual supply[D]. USDA：Oak Ridge National Laboratory，2005.

[3]張玲秀，溫雪梅，鄭小妹，等. 降解玉米秸稈纖維素真菌的篩選及產(chǎn)油特性的研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報，2012，18（17）：47-49.

[4]劉吉華，袁生，戴傳超. 一種新的絲狀真菌油脂含量快速鑒定方法[J]. 生物技術(shù)，1998，8（1）：43-44，40.

[5]Gill C O，Hall M J，Ratledge C. Lipid accumulation in an oleaginous yeast（Candida 107）growing on glucose in single-stage continuous culture[J]. Applied and Environmental Microbiology，1977，33（2）：231-239.馬曉麗，張婷婷，郭歡，等. 紅花根際磷細(xì)菌篩選、鑒定及其促生效果[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）：318-322.endprint

2.2正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表2。用SPSS Statistics 20軟件分析各因素顯著性及交互作用，結(jié)果見表3。由表3可見，各因素對產(chǎn)油率影響大小依次為氮源>纖維素濃度>初始pH值>C/N比>培養(yǎng)溫度。其中，氮源在統(tǒng)計學(xué)上顯著（P<0.05），纖維素濃度在α=0.1水平上顯著，所做3項交互作用不顯著。

3小結(jié)

本試驗以高產(chǎn)纖維素酶的1株絲狀產(chǎn)油真菌為材料，利用農(nóng)業(yè)玉米秸稈纖維素為主要碳源，通過單因素及正交試驗方法優(yōu)化產(chǎn)油發(fā)酵工藝，發(fā)現(xiàn)最優(yōu)產(chǎn)油發(fā)酵工藝為：碳源為2%纖維素+2%葡萄糖，氮源為硝酸銨，溫度為28 ℃，培養(yǎng)時間為5 d，初始pH值為4，C/N比為8 ∶1，這為進(jìn)一步開發(fā)和利用農(nóng)業(yè)秸稈、生產(chǎn)微生物油脂提供了參考，具有一定的理論研究意義和實際應(yīng)用價值。

參考文獻(xiàn)：

[1]張傳富，顧文杰，彭科峰，等. 微生物纖維素酶的研究現(xiàn)狀[J]. 生物信息學(xué)，2007，5（1）：34-36.

[2]Perlack R D，Wright L L，Turhollow A F，et al.Biomass as feedstock for a bioenergy and bioproducts industry：the technical feasibility of a billionton annual supply[D]. USDA：Oak Ridge National Laboratory，2005.

[3]張玲秀，溫雪梅，鄭小妹，等. 降解玉米秸稈纖維素真菌的篩選及產(chǎn)油特性的研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報，2012，18（17）：47-49.

[4]劉吉華，袁生，戴傳超. 一種新的絲狀真菌油脂含量快速鑒定方法[J]. 生物技術(shù)，1998，8（1）：43-44，40.

[5]Gill C O，Hall M J，Ratledge C. Lipid accumulation in an oleaginous yeast（Candida 107）growing on glucose in single-stage continuous culture[J]. Applied and Environmental Microbiology，1977，33（2）：231-239.馬曉麗，張婷婷，郭歡，等. 紅花根際磷細(xì)菌篩選、鑒定及其促生效果[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）：318-322.endprint

2.2正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表2。用SPSS Statistics 20軟件分析各因素顯著性及交互作用，結(jié)果見表3。由表3可見，各因素對產(chǎn)油率影響大小依次為氮源>纖維素濃度>初始pH值>C/N比>培養(yǎng)溫度。其中，氮源在統(tǒng)計學(xué)上顯著（P<0.05），纖維素濃度在α=0.1水平上顯著，所做3項交互作用不顯著。

3小結(jié)

本試驗以高產(chǎn)纖維素酶的1株絲狀產(chǎn)油真菌為材料，利用農(nóng)業(yè)玉米秸稈纖維素為主要碳源，通過單因素及正交試驗方法優(yōu)化產(chǎn)油發(fā)酵工藝，發(fā)現(xiàn)最優(yōu)產(chǎn)油發(fā)酵工藝為：碳源為2%纖維素+2%葡萄糖，氮源為硝酸銨，溫度為28 ℃，培養(yǎng)時間為5 d，初始pH值為4，C/N比為8 ∶1，這為進(jìn)一步開發(fā)和利用農(nóng)業(yè)秸稈、生產(chǎn)微生物油脂提供了參考，具有一定的理論研究意義和實際應(yīng)用價值。

參考文獻(xiàn)：

[1]張傳富，顧文杰，彭科峰，等. 微生物纖維素酶的研究現(xiàn)狀[J]. 生物信息學(xué)，2007，5（1）：34-36.

[2]Perlack R D，Wright L L，Turhollow A F，et al.Biomass as feedstock for a bioenergy and bioproducts industry：the technical feasibility of a billionton annual supply[D]. USDA：Oak Ridge National Laboratory，2005.

[3]張玲秀，溫雪梅，鄭小妹，等. 降解玉米秸稈纖維素真菌的篩選及產(chǎn)油特性的研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報，2012，18（17）：47-49.

[4]劉吉華，袁生，戴傳超. 一種新的絲狀真菌油脂含量快速鑒定方法[J]. 生物技術(shù)，1998，8（1）：43-44，40.

[5]Gill C O，Hall M J，Ratledge C. Lipid accumulation in an oleaginous yeast（Candida 107）growing on glucose in single-stage continuous culture[J]. Applied and Environmental Microbiology，1977，33（2）：231-239.馬曉麗，張婷婷，郭歡，等. 紅花根際磷細(xì)菌篩選、鑒定及其促生效果[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）：318-322.endprint