毛細管區(qū)帶電泳法研究杜仲葉中綠原酸含量的變化規(guī)律

摘要：以豫西南地區(qū)不同生長期杜仲葉為研究對象，建立了一種快速、簡便、重現性好的毛細管區(qū)帶電泳（capillary zone electrophoresis，CZE）方法測定杜仲葉中綠原酸的含量。毛細管區(qū)帶電泳條件如下：運行緩沖液為20 mmol/L 硼砂體系（pH值8.5），壓力進樣6 s，分離電壓為20 kV，紫外檢測波長為328 nm。該方法在0.03～0.15 mg/mL范圍內線性良好，樣品的回收率為98.74%～100.15%，RSD為1.5%（n=6）。不同采摘時間杜仲葉中綠原酸含量差異顯著，其中6月份含量最高。

關鍵詞：毛細管區(qū)帶電泳；杜仲葉；綠原酸；含量；變化規(guī)律

中圖分類號： O657.8文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0279-03

收稿日期：2013-12-11

基金項目：河南省骨干教師資助項目（編號：2009GGJS-128）。

作者簡介：張荷麗（1971—），女，河南安陽人，碩士，副教授，研究方向為分析化學。Tel：（0371）86176306；E-mail：zhangheli712@163.com。杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）中含有苯丙素類等40多種化合物，杜仲葉不僅與杜仲皮有大致相同的有效成分和藥理作用[1-4]，而且來源更豐富，成本更低。綠原酸（chlorogenic acid）具有抗菌、消炎、解毒、利膽、降壓等藥理作用[5-6]，是多種藥材和中成藥的主要有效成分和質量控制的重要指標[7]。綠原酸的測定方法主要有紫外分光光度法[8-9]、薄層色譜掃描法[10-11]、高效液相色譜法[12-16]、流動注射化學發(fā)光分析法[17-18]等，這些方法存在干擾因素多、分析時間長、檢測結果不穩(wěn)定等缺點。高效毛細管電泳法（high performance capillary electrophoresis，HPCE）[19-21]具有分離效率高、分離速度快、重現性好等特點，已被廣泛應用于中藥材各類有效成分分析和中藥復方制劑分析[22-23]。本研究應用毛細管區(qū)帶電泳法（capillary zone electrophoresis，CZE）研究了河南省鎮(zhèn)平縣栽培的杜仲葉中綠原酸含量隨生長期變化的規(guī)律。

1材料與方法

1.1儀器和試劑

HP3DCE毛細管電泳儀；8823-B紫外檢測器；未涂層彈性石英毛細管（內徑50 μm，柱長58 cm，有效長度50 cm），河北省永年縣光導纖維廠；綠原酸標準品由中國藥品生物制品檢定所提供；內標物苯甲酸鈉由北京化工廠生產；杜仲葉采摘自河南省鎮(zhèn)平縣杜仲種植基地；其他試劑均為分析純。

1.2電泳條件

毛細管在每次使用前分別用0.1 mol/L NaOH溶液沖洗2 min，去離子水沖洗2 min，運行緩沖溶液沖洗3 min，以保證重現性。每5次進樣后更換緩沖溶液。所有溶液在進樣分析前用0.45 μm微孔濾膜過濾。

從電泳緩沖體系、緩沖體系pH值、緩沖液濃度、分離電壓、進樣時間等方面考察電泳條件。

1.3內標液的配制

精確稱取0.100 0 g苯甲酸鈉，加70%乙醇超聲助溶后定容至100.0 mL容量瓶中。

1.4標準溶液的配制

精確稱取綠原酸標準品（質量濃度>98%）適量，加70%乙醇溶解，配制標準樣品貯備溶液。

1.5樣品制備

精確稱取0.500 0 g干燥研磨的杜仲葉樣品，加70%乙醇，超聲提取1 h，過濾，定容至50 mL。經0.45 μm微孔濾膜過濾，即得樣品貯備液。

1.6線性關系的考察

將一系列不同濃度的綠原酸標準品溶液（分取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL綠原酸標準樣品貯備溶液于10 mL容量瓶內，加1.0 mL內標物，用70%乙醇超聲助溶后定容），在優(yōu)化的試驗條件下進行CZE分析，每一溶液進樣2次。以標準品濃度X（mg/mL）為橫坐標，以標準品與內標物峰面積之比Y為縱坐標，繪制標準曲線。

1.7精密度考察

取標準品溶液3.0 mL于10 mL容量瓶中，加內標物 1.0 mL，用70%乙醇超聲助溶后定容，進樣測定，重復6次，測定標準品與內標物峰面積比。

1.8回收率試驗

向杜仲葉樣品提取液中準確加入綠原酸標準溶液 1.0 mL、內標物1.0 mL，在優(yōu)化條件下測定。

1.9樣品中綠原酸含量測定

分別稱取不同采集日期的杜仲葉，按“1.3”節(jié)的方法制備樣品溶液，加入內標液，按優(yōu)化的電泳條件進樣測定。

2結果與分析

2.1毛細管區(qū)帶電泳條件的優(yōu)化

毛細管電泳儀的運行條件：壓力進樣6 s；分離電壓為 20 kV；毛細管溫度為20 ℃；紫外檢測波長為328 nm；運行緩沖溶液為20 mmol/L 硼砂-磷酸二氫鈉（pH值=8.5）。

2.1.1緩沖體系的確定分別考察了硼砂、硼酸、磷酸氫二鈉、硼砂-磷酸二氫鈉等體系，其中硼砂-磷酸二氫鈉體系出峰時間、峰形、分離效果均較理想（圖1）。

2.1.2緩沖體系pH值的確定采用硼砂-磷酸二氫鈉體系，考察了pH值在7.0～10.0范圍內綠原酸分離情況。維持其他電泳條件不變，對pH值7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0進行了考察。試驗發(fā)現，當pH值在8.0～9.5 之間時，內標物與綠原酸分離效果較好；但當pH值>9.0 時，峰面積逐漸下降且遷移時間延長，不利于快速分離。綜合考慮，選擇緩沖液pH值為8.5，樣品峰形和分離度均較好（圖2）

。

2.1.3緩沖液濃度的確定采用pH值為8.5的硼砂-磷酸二氫鈉緩沖體系，在不同硼砂濃度下進行分離。試驗表明，隨著緩沖溶液濃度的增大，樣品的遷移時間延長，區(qū)帶增寬，濃度達大影響分離效果；濃度太低時，緩沖容量小，不利于體系pH值的穩(wěn)定（圖3）。最終選擇緩沖體系為20 mmol/L硼砂-磷酸二氫鈉（pH值為8.5）。endprint

2.1.4分離電壓的確定采用pH值為8.5的20 mmol/L硼砂-磷酸二氫鈉緩沖體系為運行緩沖液，分別考察了15、20、25、30 kV工作電壓對分離的影響，結果表明，升高運行電壓可以加快分析速度；但隨著電場強度的增大，基線噪音升高，使分離度下降。有時由于電流過大，焦耳熱大，還會引起緩沖溶液溫度的升高。本試驗選用20 kV作為分離電壓，可保證良好峰形和較好分離度。

2.1.5進樣時間的確定在進樣時間分別為2、4、6、8、10 s時，測定峰高。結果表明，進樣6 s后峰高增加幅度不大。進樣時間延長，使得進樣量太多，超出擴散控制的區(qū)帶寬度，導致分離度下降，樣品峰變寬；進樣時間如果太短，會降低測定的精密度，因此本試驗選擇進樣時間為6 s（圖4）。

2.2線性關系的考察

試驗結果表明，綠原酸濃度在0.03～0.15 mg/mL范圍內線性關系良好?；貧w方程為：y=15.476x+0.025 7（r=0.999 4）。

2.3精密度的考察

精密度試驗的RSD為1.1%，表明精密度良好。

2.4回收率試驗

2.5樣品中綠原酸含量測定

樣品中綠原酸含量測定結果見表2。由表2可見，不同生長發(fā)育時期杜仲葉中化學成分的變化與葉片結構有著密切的關系。4月份葉片厚度最小，結構分化不明顯，隨著時間推移，葉片厚度增加，柵欄組織與海綿組織的比值逐漸增大，7月份達到最大。杜仲葉中綠原酸的含量與柵欄組織/海綿組織的比值關系密切。在4—7月份，綠原酸含量隨葉片的生長發(fā)育而增加，最大值出現在生長最旺盛的6、7月份，最高可達32.14 mg/g，比年平均含量高出30.7%；隨著葉片生長進入衰老階段，綠原酸含量逐漸下降，到葉落時降到最低的 11.25 mg/g，比年平均含量低54.2%。

3結論

本研究應用毛細管區(qū)帶電泳，建立了簡單、靈敏、快速的CZE方法測定杜仲葉中綠原酸的含量。杜仲葉用70%乙醇超聲提取，以苯甲酸鈉為內標物，在以20 mmol/L pH值為85的硼砂-磷酸二氫鈉緩沖體系作為運行緩沖液、分離電壓為20 kV、壓力進樣為6 s、毛細管溫度為20 ℃、紫外檢測波長為328 nm的電泳條件下，測定方法的線性范圍寬，可信度高。

測定結果表明，不同采摘時間杜仲葉中綠原酸含量差異顯著。4月份至6月份綠原酸含量呈上升趨勢，7月份至11月份綠原酸含量逐漸下降，其中6月份含量最高。本研究對杜仲葉的采收和有效利用提供了理論指導。

參考文獻：

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[22]文志明，張金蘭，徐禮燊. 高效毛細管電泳法在中藥化學成分分析中的應用[J]. 中草藥，2000，31（2）：63-66.

[23]韓鳳梅，程智勇，楊新，等. 高效毛細管電泳法分離測定黃芩復方制劑中的黃芩甙[J]. 色譜，2000，18（3）：280-282.endprint

2.1.4分離電壓的確定采用pH值為8.5的20 mmol/L硼砂-磷酸二氫鈉緩沖體系為運行緩沖液，分別考察了15、20、25、30 kV工作電壓對分離的影響，結果表明，升高運行電壓可以加快分析速度；但隨著電場強度的增大，基線噪音升高，使分離度下降。有時由于電流過大，焦耳熱大，還會引起緩沖溶液溫度的升高。本試驗選用20 kV作為分離電壓，可保證良好峰形和較好分離度。

2.1.5進樣時間的確定在進樣時間分別為2、4、6、8、10 s時，測定峰高。結果表明，進樣6 s后峰高增加幅度不大。進樣時間延長，使得進樣量太多，超出擴散控制的區(qū)帶寬度，導致分離度下降，樣品峰變寬；進樣時間如果太短，會降低測定的精密度，因此本試驗選擇進樣時間為6 s（圖4）。

2.2線性關系的考察

試驗結果表明，綠原酸濃度在0.03～0.15 mg/mL范圍內線性關系良好?；貧w方程為：y=15.476x+0.025 7（r=0.999 4）。

2.3精密度的考察

精密度試驗的RSD為1.1%，表明精密度良好。

2.4回收率試驗

2.5樣品中綠原酸含量測定

樣品中綠原酸含量測定結果見表2。由表2可見，不同生長發(fā)育時期杜仲葉中化學成分的變化與葉片結構有著密切的關系。4月份葉片厚度最小，結構分化不明顯，隨著時間推移，葉片厚度增加，柵欄組織與海綿組織的比值逐漸增大，7月份達到最大。杜仲葉中綠原酸的含量與柵欄組織/海綿組織的比值關系密切。在4—7月份，綠原酸含量隨葉片的生長發(fā)育而增加，最大值出現在生長最旺盛的6、7月份，最高可達32.14 mg/g，比年平均含量高出30.7%；隨著葉片生長進入衰老階段，綠原酸含量逐漸下降，到葉落時降到最低的 11.25 mg/g，比年平均含量低54.2%。

3結論

本研究應用毛細管區(qū)帶電泳，建立了簡單、靈敏、快速的CZE方法測定杜仲葉中綠原酸的含量。杜仲葉用70%乙醇超聲提取，以苯甲酸鈉為內標物，在以20 mmol/L pH值為85的硼砂-磷酸二氫鈉緩沖體系作為運行緩沖液、分離電壓為20 kV、壓力進樣為6 s、毛細管溫度為20 ℃、紫外檢測波長為328 nm的電泳條件下，測定方法的線性范圍寬，可信度高。

測定結果表明，不同采摘時間杜仲葉中綠原酸含量差異顯著。4月份至6月份綠原酸含量呈上升趨勢，7月份至11月份綠原酸含量逐漸下降，其中6月份含量最高。本研究對杜仲葉的采收和有效利用提供了理論指導。

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[23]韓鳳梅，程智勇，楊新，等. 高效毛細管電泳法分離測定黃芩復方制劑中的黃芩甙[J]. 色譜，2000，18（3）：280-282.endprint

2.1.4分離電壓的確定采用pH值為8.5的20 mmol/L硼砂-磷酸二氫鈉緩沖體系為運行緩沖液，分別考察了15、20、25、30 kV工作電壓對分離的影響，結果表明，升高運行電壓可以加快分析速度；但隨著電場強度的增大，基線噪音升高，使分離度下降。有時由于電流過大，焦耳熱大，還會引起緩沖溶液溫度的升高。本試驗選用20 kV作為分離電壓，可保證良好峰形和較好分離度。

2.1.5進樣時間的確定在進樣時間分別為2、4、6、8、10 s時，測定峰高。結果表明，進樣6 s后峰高增加幅度不大。進樣時間延長，使得進樣量太多，超出擴散控制的區(qū)帶寬度，導致分離度下降，樣品峰變寬；進樣時間如果太短，會降低測定的精密度，因此本試驗選擇進樣時間為6 s（圖4）。

2.2線性關系的考察

試驗結果表明，綠原酸濃度在0.03～0.15 mg/mL范圍內線性關系良好?；貧w方程為：y=15.476x+0.025 7（r=0.999 4）。

2.3精密度的考察

精密度試驗的RSD為1.1%，表明精密度良好。

2.4回收率試驗

2.5樣品中綠原酸含量測定

樣品中綠原酸含量測定結果見表2。由表2可見，不同生長發(fā)育時期杜仲葉中化學成分的變化與葉片結構有著密切的關系。4月份葉片厚度最小，結構分化不明顯，隨著時間推移，葉片厚度增加，柵欄組織與海綿組織的比值逐漸增大，7月份達到最大。杜仲葉中綠原酸的含量與柵欄組織/海綿組織的比值關系密切。在4—7月份，綠原酸含量隨葉片的生長發(fā)育而增加，最大值出現在生長最旺盛的6、7月份，最高可達32.14 mg/g，比年平均含量高出30.7%；隨著葉片生長進入衰老階段，綠原酸含量逐漸下降，到葉落時降到最低的 11.25 mg/g，比年平均含量低54.2%。

3結論

本研究應用毛細管區(qū)帶電泳，建立了簡單、靈敏、快速的CZE方法測定杜仲葉中綠原酸的含量。杜仲葉用70%乙醇超聲提取，以苯甲酸鈉為內標物，在以20 mmol/L pH值為85的硼砂-磷酸二氫鈉緩沖體系作為運行緩沖液、分離電壓為20 kV、壓力進樣為6 s、毛細管溫度為20 ℃、紫外檢測波長為328 nm的電泳條件下，測定方法的線性范圍寬，可信度高。

測定結果表明，不同采摘時間杜仲葉中綠原酸含量差異顯著。4月份至6月份綠原酸含量呈上升趨勢，7月份至11月份綠原酸含量逐漸下降，其中6月份含量最高。本研究對杜仲葉的采收和有效利用提供了理論指導。

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