尼達(dá)尼布脂質(zhì)體治療肺纖維化大鼠效果及其機(jī)制

，

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院消毒供應(yīng)科，陜西 西安 710061)

肺纖維化是由于感染特殊病毒、長期暴露于放射環(huán)境或長期接觸微溶毒素等多種原因?qū)е碌姆伍g質(zhì)疾病晚期的共同結(jié)果[1]。研究表明肺纖維化也是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性硬化癥患者的常見并發(fā)癥[2]。肺纖維化以肺泡損傷、肺間質(zhì)增厚及肺泡細(xì)胞外基質(zhì)持續(xù)損傷、重建和彈性纖維過度沉積，肺泡壁破損和肺泡微血管功能缺失為主要病理特點(diǎn)[3]。目前臨床上主要應(yīng)用皮質(zhì)類固醇、細(xì)胞毒藥物、免疫抑制劑等藥物進(jìn)行治療，這些藥物治療不但會引起骨髓抑制、彌漫性肺泡出血等一系列副作用，而且抗纖維化作用往往不顯著[4]，因此目前急需尋找有效防治藥物。研究表明尼達(dá)尼布作為一種多重酪氨酸激酶抑制劑，在治療特發(fā)性肺纖維化的臨床應(yīng)用中取得了顯著效果[5]。脂質(zhì)體屬于一種特殊藥物載體，與藥物結(jié)合后可提高其生物利用率并增加其穩(wěn)定性，目前對于尼達(dá)尼布脂質(zhì)體治療肺纖維化的研究較少，本文旨在探究尼達(dá)尼布脂質(zhì)體對大鼠肺纖維化治療效果及其對血清羥脯氨酸、前列腺素E2水平和自主活動次數(shù)的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 120只SD雄性大鼠由四川達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，周齡6～8周，體重180～220g。將大鼠飼養(yǎng)在溫度21～25℃，濕度45～55%的空調(diào)房內(nèi)，保持12小時晝夜節(jié)律，并保持提供充足的水和食物。

1.1.2 主要試劑 尼達(dá)尼布脂質(zhì)體(南方醫(yī)科大學(xué)藥劑實(shí)驗(yàn)室制備)；羥脯氨酸含量測定試劑盒(上海建成康美工程有限公司)；Masson染色試劑盒(北京達(dá)美吉基生物公司) ；PGE2試劑盒(南京舒麗雅生物科技有限公司)；YLBCR多功能大鼠自主活動記錄儀(安徽豐川正華生物儀器設(shè)備有限公司)。

1.1.3 主要儀器 紫外分光光度計(jì)(Perkin Elmer)，低溫高速離心機(jī)(Hermel)，顯微鏡(蔡司)，YLBCR多功能大鼠自主活動記錄儀(安徽豐川正華生物儀器設(shè)備有限公司)，全自動輪轉(zhuǎn)式病理組織切片機(jī)(Leica RM2265)。

1.2方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 120只SD大鼠隨機(jī)分為以下4組(每組30只大鼠)：A組：正常對照組，B組：肺纖維化模型組，C組：尼達(dá)尼布脂質(zhì)體高劑量組，D組：尼達(dá)尼布脂質(zhì)體低劑量組。飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境后，用30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，消毒需切開部位，行氣管正中切口，暴露氣管后，A組大鼠氣管內(nèi)滴注0.2～0.3mL生理鹽水，B、C、D三組大鼠氣管內(nèi)滴注同體積博來霉素(5 mg/kg )，滴注完畢后，為使滴注藥物在肺內(nèi)分布均勻，將大鼠保持直立并不斷旋轉(zhuǎn)5min，隨后逐層縫合，手術(shù)后注意傷口隔天換藥預(yù)防感染。4周后C組、D組分別予以尼達(dá)尼布脂質(zhì)體灌胃(40mg/kg.d，80mg/kg.d)，B組予以0.9%0.2mL生理鹽水灌胃。連續(xù)灌胃4周后處死4組大鼠，注意每周重新稱量老鼠體重，調(diào)整藥物灌胃劑量。

1.2.2 組織學(xué)觀察 取大鼠右肺組織，用10%甲醛固定，石蠟包埋后病理組織切片機(jī)切片，分別進(jìn)行HE染色和Masson染色，并由兩位病理科醫(yī)生用雙人盲法采用倒置顯微鏡、病理圖像分析儀閱片，參照 Ashcroft 評分方法[6]，對組織切片纖維化程度進(jìn)行評分。評分細(xì)則如下：肺組織正常，0分；肺泡壁及細(xì)支氣管壁輕微纖維化增厚，1～2分；肺泡壁及細(xì)支氣管壁中度纖維化增厚，但不伴明顯的肺結(jié)構(gòu)損傷，3～4分；肺泡壁及細(xì)支氣管壁重度纖維化增厚，并伴明確的肺結(jié)構(gòu)損傷，5～6分；有大范圍纖維化及肺結(jié)構(gòu)廣泛破壞，7～8分。

1.2.3 各組血清羥脯氨酸、前列腺素E2含量測定 抽取已處死大鼠右心室血液2～5ml,將血液樣本標(biāo)記后靜置2 h，2000r/min離心10分鐘后，取上清液，置于-20℃待用。血清Hyp、PGE2含量采用ELISA法測定，操作步驟嚴(yán)格遵循測試盒說明書。

1.2.4 各組自主活動次數(shù)測定 用實(shí)驗(yàn)功能大鼠自主活動記錄儀記錄儀測定最后一次給藥10min后各組大鼠5 min內(nèi)活動次數(shù)，再用同樣方法記錄最后一次給藥 20min、30min、40min、50min、60min 后大鼠5min內(nèi)自主活動次數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1鏡下觀察不同濃度尼達(dá)尼布脂質(zhì)體對肺纖維化形態(tài)的影響

2.1.1 HE染色結(jié)果 對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，結(jié)構(gòu)未見明顯異常，肺泡壁表面光滑，形態(tài)清晰，肺泡腔清晰且無滲出分泌物，肺泡間隔未見增厚(圖1A)。與生理鹽水處理對照組大鼠的正常肺泡形態(tài)相比，氣管內(nèi)滴注博萊霉素刺激4周后肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁明顯增厚，白細(xì)胞大量浸潤，肺泡間隔大量膠原纖維沉積(圖1B)。尼達(dá)尼布脂質(zhì)體高劑量處理的大鼠肺內(nèi)可見：與氣管內(nèi)滴注博萊霉素B組大鼠相比，肺泡、肺泡間隔僅有少量炎性細(xì)胞，肺泡間增寬有所緩解，肺泡間隔沉積的膠原纖維明顯減少，肺部纖維化程度顯著緩解(圖1C)。尼達(dá)尼布脂質(zhì)體低劑量處理的大鼠肺內(nèi)可見：與氣管內(nèi)滴注博萊霉素B組大鼠相比，肺泡、肺泡間隔有少量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間增寬稍有緩解，肺泡間隔沉積的膠原纖維減少，肺部纖維化程度有所緩解，但未達(dá)到尼達(dá)尼布脂質(zhì)體高劑量處理水平(圖1D)。

2.1.2 Masson染色結(jié)果 正常對照組大鼠肺組織血管壁及肺泡壁可見有少量膠原纖維組織，肺泡及肺間質(zhì)則未見膠原纖維組織沉積(圖2A)。與生理鹽水處理對照組大鼠的正常肺泡形態(tài)相比，氣管內(nèi)滴注博萊霉素刺激4周后，支氣管壁及肺間質(zhì)可見大量膠原纖維顯著增生(圖2B)。尼達(dá)尼布脂質(zhì)體高劑量處理的大鼠肺內(nèi)可見：肺內(nèi)血管壁及肺泡壁僅有少量的膠原纖維，纖維化程度較正常組明顯緩解，提示高劑量尼達(dá)尼布脂質(zhì)體治療有效(圖2C)。尼達(dá)尼布脂質(zhì)體低劑量處理的大鼠肺內(nèi)可見：肺內(nèi)血管壁少量膠原纖維增生，纖維化程度較正常組稍有緩解，但未達(dá)到尼達(dá)尼布脂質(zhì)體高劑量處理水平(圖2D)。

圖1 4周后肺組織切片HE染色結(jié)果(100×)A：正常對照大鼠；B：肺纖維化大鼠；C：高劑量尼達(dá)尼布脂質(zhì)體治療組；D：低劑量尼達(dá)尼布脂質(zhì)體治療組.

圖2 4周后肺組織切片Masson染色結(jié)果(100×)A：正常對照大鼠；B：肺纖維化大鼠；C：高劑量尼達(dá)尼布脂質(zhì)體治療組；D：低劑量尼達(dá)尼布脂質(zhì)體治療組.

2.2各組大鼠Aschroft評分比較Aschroft 評分是通過肺組織結(jié)構(gòu)破壞程度及肺纖維組織增生情況衡量評價肺組織纖維化程度評分方法。如圖3所示，研究結(jié)果顯示：B組大鼠肺纖維評分顯著高于A組(P<0.05) ，提示B組大鼠肺部纖維化病變明顯，且與B組相比，C組和D組的大鼠肺纖維評分均有所降低(P<0.05)，提示用尼達(dá)尼布脂質(zhì)體治療后，C組和D組大鼠肺纖維化水平有所緩解，但是高劑量尼達(dá)尼布脂質(zhì)體治療大鼠肺纖維化緩解水平優(yōu)于低劑量尼達(dá)尼布脂質(zhì)體治療大鼠肺纖維化緩解水平(P<0.05) 。詳見圖3。

圖3 各組大鼠Aschroft 評分比較結(jié)果A：正常對照大鼠；B：肺纖維化大鼠；C：高劑量尼達(dá)尼布脂質(zhì)體治療組；D：低劑量尼達(dá)尼布脂質(zhì)體治療組.與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，ΔP<0.05

2.3各組血清羥脯氨酸、前列腺素E2水平比較研究結(jié)果顯示：B組大鼠血清羥脯氨酸、前列腺素E2水平顯著高于A組(P<0.05) ，且與B組相比，C組和D組的血清羥脯氨酸、前列腺素E2水平均有所降低(P<0.05)，提示用尼達(dá)尼布脂質(zhì)體治療后，C組和D組大鼠肺纖維化水平有所緩解，但是高劑量尼達(dá)尼布脂質(zhì)體治療大鼠血清羥脯氨酸、前列腺素E2下降水平較高劑量尼達(dá)尼布脂質(zhì)體下降水平大(P<0.05) 。詳見圖4。

2.4各組大鼠自主活動次數(shù)比較研究結(jié)果顯示：B組大鼠20min、30min、50min、后大鼠5min內(nèi)自主活動次數(shù)均較A組顯著增加(P<0.05)，且與B組相比，C組和D組的大鼠20min、30min、50min、后大鼠5min內(nèi)自主活動次數(shù)均有所減少(P<0.05)，但是高劑量尼達(dá)尼布脂質(zhì)體治療后大鼠大鼠20min、30min、50min、后大鼠5min內(nèi)自主活動減少次數(shù)較低劑量尼達(dá)尼布脂質(zhì)體下降水平小(P<0.05) 。提示用尼達(dá)尼布脂質(zhì)體治療肺纖維化不會影響大鼠自主活動次數(shù)，詳見圖5。

圖4 各組血清羥脯氨酸、前列腺素E2水平比較結(jié)果A：正常對照大鼠；B：肺纖維化大鼠；C：高劑量尼達(dá)尼布脂質(zhì)體治療組；D：低劑量尼達(dá)尼布脂質(zhì)體治療組.與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，ΔP<0.05

圖5 各組大鼠自主活動次數(shù)比較A：生理鹽水治療對照大鼠；B：博來霉素處理的大鼠；C：高劑量尼達(dá)尼布脂質(zhì)體治療博來霉素處理的大鼠；D：低劑量尼達(dá)尼布脂質(zhì)體治療博來霉素處理的大鼠。

3 討 論

肺纖維化是感染特殊病毒、長期暴露于放射環(huán)境或長期接觸微溶毒素等多種原因?qū)е碌姆伍g質(zhì)疾病晚期的共同結(jié)果。研究表明肺纖維化也是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性硬化癥患者的常見并發(fā)癥[7]。肺纖維化以肺泡損傷、肺間質(zhì)增厚及肺泡細(xì)胞外基質(zhì)持續(xù)損傷、重建和彈性纖維過度沉積，肺泡壁破損和肺泡微血管功能缺失為主要病理特點(diǎn)。目前臨床上主要應(yīng)用皮質(zhì)類固醇、細(xì)胞毒藥物、免疫抑制劑等進(jìn)行治療，這些藥物治療不但會引起骨髓抑制、彌漫性肺泡出血等一系列副作用，而且抗纖維化作用往往不顯著，因此目前急需尋找有效防治手段。在動物實(shí)驗(yàn)中，可通過放射線或閉塞細(xì)支氣管誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性動物肺纖維化模型，但是尚不清楚上述疾病模型是否能完全模擬人類肺纖維化疾病模型[8]。近年來，因博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化動物模型的特點(diǎn)與人肺纖維化臨床特點(diǎn)高度相近，受到了研究者的廣泛關(guān)注。人肺纖維化的主要病理特征為肺泡上皮細(xì)胞損傷，成纖維細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的沉積，引起正常肺結(jié)構(gòu)破壞和氣體交換進(jìn)行性減少[9]。研究表明氣管內(nèi)滴注博萊霉素會引起炎性細(xì)胞浸潤導(dǎo)致急性肺部炎癥，活化的炎癥細(xì)胞和成纖維細(xì)胞可以合成并釋放大量活性氧、趨化因子、細(xì)胞因子和蛋白酶，從而導(dǎo)致大鼠肺部產(chǎn)生大量膠原蛋白進(jìn)而形成纖維增生[10]。本研究也發(fā)現(xiàn)，大鼠氣管內(nèi)滴注博萊霉素博4周后導(dǎo)致彌漫性肺泡間隔增厚，肺泡內(nèi)可見大量滲出液，肺組織間隙大量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤，這與臨床上人肺纖維化病理特征一致。

尼達(dá)尼布作為一種特殊的多重酪氨酸激酶抑制劑，可有效抑制VEGFR1，VEGFR2， VEGFR3，PDGFRα、PDGFRβ及FGFR1，F(xiàn)GFR2，F(xiàn)GFR3。VEGF是一種同源二聚體糖蛋白，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、促進(jìn)新生血管形成、增加血管通透性，研究表明VEGF增加可促進(jìn)肺纖維化形成[11]。PDGF是一種可調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的生長因子，其可刺激肌成纖維細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞，合成分泌大量膠原酶，從而破壞正常肺組織內(nèi)膠原纖維[12]。研究發(fā)現(xiàn)PDGF可通過MAPK通路增加I型膠原合成，說明PDGF在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中揮重要作用[13]。FGF可刺激內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞增殖，Englinger B等[14]研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可介導(dǎo)FGF2/ERK 信號通路促進(jìn)成纖維細(xì)胞聚集，促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生。這說明在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中，F(xiàn)GF、VEGF、PDGF起到了重要的促進(jìn)作用，而尼達(dá)尼布可通過抑制FGF、VEGF、PDGF進(jìn)而抑制肺纖維化的發(fā)生。脂質(zhì)體是一種磷脂在水溶液中形成的微小囊泡，其結(jié)構(gòu)類似于生物膜結(jié)構(gòu)，其與藥物結(jié)合后可作為藥物載體，提高治療藥物的的靶向性、穩(wěn)定性，并在藥物代謝吸收后可自行降解，且無毒性及免疫原性[15]。本文發(fā)現(xiàn)將脂質(zhì)體與尼達(dá)尼布有效結(jié)合，可有效降低大鼠肺纖維化。

羥脯氨酸不同于普通氨基酸，是在膠原蛋白中的一種特殊氨基酸，也是膠原蛋白特有的，其含量同時也可以代表特定部位膠原的含量，故檢測血清羥脯氨酸可反映大鼠肺纖維化嚴(yán)重程度并判斷藥物治療效果。前列腺素E2是一種不飽和脂肪酸，是鼠和人肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)花生四烯酸代謝主要產(chǎn)物，其通過調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶信號有效抑制成纖維細(xì)胞增殖，同時抑制膠原基因轉(zhuǎn)錄。因此檢測血清前列腺素E2可有效判斷肺部纖維化水平，評估藥物治療預(yù)后水平。與肺纖維化組大鼠相比，藥物治療組的血清羥脯氨酸、前列腺素E2水平均有所降低，且高劑量尼達(dá)尼布脂質(zhì)體治療大鼠血清羥脯氨酸、前列腺素E2下降水平較低劑量尼達(dá)尼布脂質(zhì)體下降水平大。用藥后的大鼠20min、30min、50min、后大鼠5min內(nèi)自主活動次數(shù)均有所減少，且高劑量尼達(dá)尼布脂質(zhì)體治療后大鼠20min、30min、50min、后大鼠5min內(nèi)自主活動減少次數(shù)較低劑量尼達(dá)尼布脂質(zhì)體下降水平小。其綜上所述，尼達(dá)尼布脂質(zhì)體能治療肺纖維化機(jī)制可能與降低血清羥脯氨酸、前列腺素E2水平且自主活動次數(shù)與其劑量無關(guān)。