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    多菌靈及其雜質(zhì)和代謝物對(duì)赤子愛(ài)勝蚯蚓的急性毒性和遺傳毒性

    2014-11-14 00:01:01郇志博羅金輝
    熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年10期
    關(guān)鍵詞:微核苯并咪唑多菌靈

    郇志博 羅金輝

    摘 要 分別使用土壤培養(yǎng)法和血細(xì)胞微核試驗(yàn)測(cè)定多菌靈及其雜質(zhì)(2,3-二氨基酚嗪和2-氨基-3-羥基酚嗪)和代謝物(2-氨基苯并咪唑)對(duì)赤子愛(ài)勝蚯蚓的急性毒性和遺傳毒性。結(jié)果表明:多菌靈、2,3-二氨基酚嗪和2-氨基-3-羥基酚嗪和2-氨基苯并咪唑?qū)Τ嘧訍?ài)勝蚯蚓7 d的LC50分別為8.60、14.84、18.92和27.72 mg/kg干土,多菌靈對(duì)蚯蚓的毒性為中毒,其他3種化合物為低毒。微核試驗(yàn)結(jié)果表明:多菌靈能明顯誘導(dǎo)赤子愛(ài)勝蚯蚓血細(xì)胞產(chǎn)生微核,并且隨著暴露劑量和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)微核率增加;其他3種物質(zhì)在測(cè)定劑量和測(cè)定時(shí)間下,微核率與空白對(duì)照差異不顯著。

    關(guān)鍵詞 多菌靈 ;2,3-二氨基酚嗪 ;2-氨基-3-羥基酚嗪 ;2-氨基苯并咪唑 ;急性毒性 ;遺傳毒性

    分類(lèi)號(hào) X171.5

    多菌靈是一種內(nèi)吸性苯并咪唑類(lèi)殺菌劑,常用于防治多種真菌性病害,如炭疽病、霜霉病、銹病、瘡痂病、褐斑病等,在果蔬、茶葉和觀賞植物上廣泛應(yīng)用[1]。中國(guó)年產(chǎn)多菌靈原藥超過(guò)1萬(wàn) t,占中國(guó)殺菌劑總量的1/4[2]。截止2012年7月, 中國(guó)共有857家農(nóng)藥廠登記各種多菌靈的單一及復(fù)配制劑,且多菌靈還是其他苯并咪唑類(lèi)殺菌劑(如:苯菌靈、噻菌靈和托布津等)的活性成分和代謝產(chǎn)物[3],多菌靈降解速度緩慢,在土壤中培養(yǎng)250 d后,仍會(huì)有5%~13%的多菌靈殘存于土壤中[4],而且多菌靈在水果、蔬菜中殘留超標(biāo)的情況也時(shí)有發(fā)生[5-6]。

    2012年1月,美國(guó)可口可樂(lè)公司和百事公司的橙汁產(chǎn)品檢出極少量殺菌劑多菌靈,由于多菌靈可疑的損傷遺傳物質(zhì)的作用,引起全球范圍的“果汁”恐慌[7]。2012年4月國(guó)際環(huán)保組織“綠色和平”調(diào)查北京、成都和海口的9個(gè)茶葉品牌,檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)18份茶葉有14份含有多菌靈等可能影響生育能力、胎兒發(fā)育或可能損害遺傳基因的殘留農(nóng)藥[8]。

    20世紀(jì)80年代就有關(guān)于多菌靈的毒性報(bào)道,至90年代,多菌靈已被世界衛(wèi)生組織列為可疑的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。多菌靈的大鼠急性經(jīng)口LC50>15 000 mg/kg,經(jīng)皮LC50>2 000 mg/kg,小鼠口服LC50為5 000 mg/kg,按中國(guó)農(nóng)藥毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)屬于低毒殺菌劑[9]。但多菌靈是否具有遺傳毒性,眾說(shuō)紛紜。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期大量喂食含多菌靈的飼料可以提高小鼠肝臟良、惡性腫瘤的發(fā)病率,且與給藥量有著明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系;另一些學(xué)者卻研究發(fā)現(xiàn),多菌靈可能不是一種致突變物,因?yàn)榻o大鼠喂食含1 000 mg/kg多菌靈的飼料4個(gè)月,結(jié)果顯示為陰性[9]。曹柳燕等[10]研究發(fā)現(xiàn),多菌靈的致癌性與雜質(zhì)2,3-二氨基酚嗪(DAP)和2-氨基-3-羥基酚嗪(HAP)有關(guān),通過(guò)改善多菌靈的生產(chǎn)工藝,可以減少雜質(zhì)含量,降低多菌靈的遺傳毒性;于功昌等[9]認(rèn)為,多菌靈的致癌性與其代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(2-氨基苯并咪唑)有關(guān)。因此,弄清多菌靈是否具有遺傳毒性以及其遺傳毒性與雜質(zhì)和代謝物的關(guān)系,對(duì)保護(hù)消費(fèi)者的健康和保障食品安全具有重要意義。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 供試動(dòng)物和藥劑

    赤子愛(ài)勝蚯蚓(Eisenia foetida)購(gòu)自天津賈立明養(yǎng)殖公司,每條體重約200~300 mg,經(jīng)實(shí)驗(yàn)室預(yù)培養(yǎng),環(huán)帶明顯、大小基本一致的健康成蚓,試驗(yàn)前清腸24 h。

    多菌靈、2,3-二氨基酚嗪(DAP)、2-氨基-3-羥基酚嗪(HAP)和2-氨基苯并咪唑標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自SIGMA公司。

    1.1.2 試驗(yàn)設(shè)備和條件

    光學(xué)顯微鏡(YS100,尼康);光照培養(yǎng)箱(HPG-280B,哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)。

    試驗(yàn)用人工土壤由10%泥炭蘚、20%高嶺土、68%石英砂和2%碳酸鈣組成,充分混勻后待用。

    1.2 方法

    1.2.1 急性毒性試驗(yàn)

    參照劉偉等[11]的研究方法,先做預(yù)試驗(yàn),求出各種化合物對(duì)蚯蚓7 d全致死的最低濃度和全存活的最高濃度,在此范圍內(nèi)設(shè)置5個(gè)處理組,設(shè)立溶劑對(duì)照和空白對(duì)照,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)10條蚯蚓。先將丙酮配制的系列濃度的化合物與10 g人工土壤混勻,待丙酮充分揮發(fā)后,再與490 g人工土壤充分混勻,調(diào)節(jié)水分,使其含水量約為30%,然后放入蚯蚓,置于2 L燒杯中,用塑料薄膜封口,并用解剖針在薄膜上扎孔,置(20±1)℃、濕度80%~85%的培養(yǎng)箱中,400~800 Lx光強(qiáng)連續(xù)光照,于第7天倒出瓶?jī)?nèi)土壤,記錄蚯蚓死亡數(shù)(用針輕觸蚯蚓尾部,蚯蚓無(wú)反應(yīng)則為死亡),及時(shí)清除死蚯蚓。根據(jù)蚯蚓7 d的死亡率,求出各個(gè)化合物對(duì)蚯蚓的急性毒性LC50值及95%置信限。

    1.2.2 微核試驗(yàn)

    根據(jù)急性毒性試驗(yàn)各個(gè)化合物的LC50值,設(shè)置多菌靈試驗(yàn)濃度為0.4、1.2、3.6 mg/kg干土;2,3-二氨基酚嗪濃度、2-氨基-3-羥基酚嗪濃度為0.6、1.8、5.4 mg/kg干土;2-氨基苯并咪唑濃度為0.8、2.4、7.2 mg/kg干土。設(shè)置空白(水)對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照(絲裂霉素)0.4 mg/kg干土,染毒方法同急性毒性試驗(yàn)方法,于處理后的第7、14、21天取出蚯蚓,制備血細(xì)胞涂片并進(jìn)行顯微觀察,每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)10條蚯蚓。

    將染毒后的蚯蚓浸入蒸餾水中并逐滴加入濃度為95%酒精,使蚯蚓麻醉,然后用濾紙吸干多余液體,用小剪刀將蚯蚓的背部剪破后取血,迅速涂片,晾干,甲醇固定15 min,15% Giemsa染色液(用0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋,pH 6.8)染色15 min,用去離子水沖洗,電熱吹風(fēng)吹干,400倍顯微鏡觀察。每個(gè)重復(fù)取2條蚯蚓,每條蚯蚓制備1張涂片,每張涂片觀察約500個(gè)血細(xì)胞,記錄微核細(xì)胞數(shù)目,計(jì)算微核率,觀察結(jié)果以千分率表示。微核判斷標(biāo)準(zhǔn):位于有核血細(xì)胞胞漿中,與主核完全分開(kāi),呈圓形或橢圓形藍(lán)紫色顆粒,邊緣光滑,染色性質(zhì)與主核一致,大小為主核的1/3以下[12]。

    1.2.3 數(shù)據(jù)處理

    根據(jù)不同濃度下的死亡率,使用軟件SPSS16.0的Probit模型計(jì)算各個(gè)化合物對(duì)蚯蚓的急性毒性LC50值及95%置信限;微核率的結(jié)果表示為[平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)],使用SPSS的單因素方差分析法分析不同濃度處理區(qū)組間差異,若差異明顯,用SPSS的最小顯著極差法(LSD)進(jìn)行多重比較。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 4種物質(zhì)對(duì)蚯蚓的急性毒性

    4種物質(zhì)土壤染毒后蚯蚓的中毒癥狀類(lèi)似:低濃度下,體色變暗,卷曲、僵硬,生殖環(huán)腫脹,高濃度處理后蚯蚓背部出現(xiàn)水泡、滲血現(xiàn)象,隨著中毒時(shí)間延長(zhǎng),高濃度處理組蚯蚓滲血現(xiàn)象嚴(yán)重,生殖環(huán)潰爛,體節(jié)延長(zhǎng),蚯蚓尾部有斷節(jié)現(xiàn)象。

    蚯蚓是評(píng)價(jià)化學(xué)農(nóng)藥安全性的一種重要的指示生物。目前中國(guó)劃定的農(nóng)藥對(duì)蚯蚓毒性等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為高毒(LC50≤1 mg/kg干土),中毒(1 mg/kg干土10 mg/kg干土)(《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》)。由表1可知,多菌靈LC50為8.60 mg/kg干土為中毒,2,3-二氨基酚嗪LC50為14.84 mg/kg干土為低毒,2-氨基-3-羥基酚嗪LC50為18.92 mg/kg干土為低毒,2-氨基苯并咪唑LC50為27.72 mg/kg干土為低毒。

    2.2 微核試驗(yàn)

    表2數(shù)據(jù)表明,隨著多菌靈濃度的升高,在相同的染毒時(shí)間內(nèi),蚯蚓血細(xì)胞的微核率顯著性升高。在同一濃度下,隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng),蚯蚓血細(xì)胞的微核率也有所提高(P<0.05),空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照的試驗(yàn)結(jié)果表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)可信。通過(guò)400倍的顯微鏡觀察,多菌靈誘導(dǎo)的蚯蚓血細(xì)胞微核清晰可見(jiàn)(圖1)。表2、3和4表明,多菌靈的2種雜質(zhì)2,3-二氨基酚嗪(DAP)和2-氨基-3-羥基酚嗪(HAP)和1種代謝物2-氨基苯并咪唑?qū)︱球狙?xì)胞微核的誘導(dǎo)作用與空白對(duì)照相比差異不顯著(P>0.05),而且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),其微核率與空白對(duì)照相比差異也不顯著(P>0.05)。

    3 結(jié)論

    微核是細(xì)胞經(jīng)輻射或化學(xué)藥物的作用后,在有絲分裂過(guò)程中形成的落后染色體、染色體橋、染色斷片、環(huán)狀染色體等在末期以后形成的1個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核。一般產(chǎn)生的微核數(shù)與外界誘變因子的強(qiáng)弱成正比,所以可用微核出現(xiàn)的千分率來(lái)評(píng)價(jià)污染物對(duì)生物遺傳物質(zhì)影響的程度,微核率已被國(guó)際誘變劑、致癌劑保護(hù)委員會(huì)推薦為檢查致癌劑、誘變劑常用的遺傳毒理方法之一[13]。

    至于多菌靈誘導(dǎo)產(chǎn)生微核的機(jī)理,黎杰強(qiáng)等[13]通過(guò)蠶豆微核試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),多菌靈一是通過(guò)干擾有絲分裂過(guò)程中紡錘體的形成,引起細(xì)胞不能正常有絲分裂,致使一到數(shù)條染色體在有絲分裂后期不能進(jìn)入細(xì)胞核,而單獨(dú)留在細(xì)胞質(zhì)中形成微核;二是多菌靈直接導(dǎo)致染色體斷裂和粘連。吳麗明等[14]通過(guò)對(duì)雄性小鼠生殖細(xì)胞的染色體觀察發(fā)現(xiàn),多菌靈能誘發(fā)小鼠精母細(xì)胞染色體畸變率增加,畸變的類(lèi)型有形成染色體斷片、環(huán)狀四價(jià)體和鏈狀四價(jià)體等。

    本研究表明:多菌靈對(duì)赤子愛(ài)勝蚯蚓的毒性等級(jí)為中毒,雜質(zhì)(2,3-二氨基酚嗪和2-氨基-3-羥基酚嗪)和代謝物(2-氨基苯并咪唑)對(duì)赤子愛(ài)勝蚯蚓為低毒;多菌靈能明顯誘導(dǎo)赤子愛(ài)勝蚯蚓血細(xì)胞產(chǎn)生微核,并且隨著暴露劑量和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)微核率增加,因此多菌靈是一種潛在的誘變劑和致癌劑;建議目前的食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估在關(guān)注農(nóng)藥殘留的急性毒性的同時(shí),加強(qiáng)關(guān)注多菌靈類(lèi)似農(nóng)藥的誘變作用和致癌作用;另外雜質(zhì)(2,3-二氨基酚嗪和2-氨基-3-羥基酚嗪)和代謝物(2-氨基苯并咪唑)對(duì)蚯蚓血細(xì)胞染色體畸變的誘導(dǎo)作用不明顯,因此多菌靈的致癌致畸作用可能與這幾種物質(zhì)無(wú)關(guān)。

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