巴西橡膠樹紅根病病菌液體培養(yǎng)條件優(yōu)化研究

林仕愷 涂敏 魯紅學(xué) 王曉芳 蔡海濱 胡彥師 孫愛花 程漢

摘 要 通過設(shè)置不同碳源、氮源、溫度、菌齡等對巴西橡膠樹紅根病病菌[Ganoderma pseudoferreum （Wakef） Over.et Steinm]進行液體培養(yǎng)試驗。結(jié)果表明：適合橡膠樹紅根病病菌菌絲生長的液體培養(yǎng)基配方為：蔗糖1%，葡萄糖2%，D-果糖2%，玉米粉0.5%，酵母粉0.5%，黃豆粉0.8%，蛋白胨1%，KH2PO4 0.1%，MgSO4 0.1%，VB1 0.02%；最適培養(yǎng)溫度是29℃，液體菌種菌齡為120 h，培養(yǎng)周期為240 h。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹 ；橡膠靈芝 ；液體培養(yǎng) ；優(yōu)化

分類號 S432

橡膠樹紅根病是巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）危害面積最廣、影響最大的世界性根部傳染性病害，病原菌為橡膠靈芝[Ganoderma pseudoferreum （Wakef） Over. et Steinm][1]，具有寄主較多[2]、潛伏期長[3]、在土壤中蔓延迅速[4]、對干膠產(chǎn)量影響嚴重等特點[5-6]。目前紅根病在中國海南和云南植膠區(qū)普遍發(fā)生，發(fā)病嚴重的林段發(fā)病率達到40%，若沒有及時處理，則死亡率為100%[7]。與固體培養(yǎng)相比，液體培養(yǎng)具有周期短、產(chǎn)量高等優(yōu)點，能在短時間內(nèi)獲得大量菌絲體，便于開展分子生物學(xué)及病害防控方面的研究。本研究通過設(shè)置不同碳源、氮源、溫度、菌齡等對橡膠靈芝進行液體培養(yǎng)試驗，以篩選適合橡膠靈芝菌絲生長的培養(yǎng)基配方，為進一步提高菌絲體產(chǎn)量及開展相關(guān)研究提供有效參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

橡膠靈芝菌（G. pseudoferreum）GP1采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗場三隊（海南省儋州市），由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所分離培養(yǎng)。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）活化培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，瓊脂粉15 g，水1 000 mL，pH 7；（2）液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基：胰蛋白胨2%，葡萄糖4%，酵母粉0.5%，KH2PO4 0.1%，MgSO4 0.1%，VB1 0.02%。

1.2 方法

1.2.1 液體菌種的制備

取1塊活化菌種接種于活化培養(yǎng)基平板上，于29℃培養(yǎng)168 h，切取1 mm×1 mm菌絲塊轉(zhuǎn)接于裝有100 mL液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，每瓶20塊，以29℃、160 r/min培養(yǎng)240 h。

1.2.2 液體培養(yǎng)生長曲線的測定

100 mL液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中接種1/10體積的液體菌種，置于500 mL三角瓶中震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同1.2.1。接種48 h后開始取樣測菌絲體生物量，每24 h取1次，直到第288 h，每次3個重復(fù)。

1.2.3 菌絲體生物量測定

將100 mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的紅根菌菌絲體進行抽濾，以50℃烘干至恒重即為菌絲體生物量。

1.2.4 培養(yǎng)基碳、氮源優(yōu)化試驗

碳源選擇3個因素，即葡萄糖、蔗糖、D-果糖，氮源為黃豆粉、酵母粉、玉米粉、蛋白胨，其他無機鹽及維生素比例同1.1.2的（2）中液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件和菌絲體生物量測定同1.2.2。利用正交設(shè)計助手3.1版設(shè)計L18（37）正交實驗，各因素水平見表1，每個處理3次重復(fù)。

1.2.5 培養(yǎng)溫度對菌絲體生物量的影響

培養(yǎng)溫度設(shè)為23、25、27、29、31和33℃，每個處理3次重復(fù)，培養(yǎng)基使用1.2.4優(yōu)化配方，接種、培養(yǎng)和菌絲體生物量測定同上。

1.2.6 菌種菌齡對菌絲體生物量的影響試驗

液體菌種的菌齡分別為48、72、96、120、144和168 h，每個處理3次重復(fù)，培養(yǎng)溫度為29℃，其他同1.2.5。

1.2.7 液體培養(yǎng)的菌絲體致病性驗證試驗

采用2種方法對橡膠樹組培苗熱研7-33-97進行接種試驗，驗證液體培養(yǎng)的菌絲體是否仍具有致病性。（1）浸根接種法：待橡膠靈芝菌液體培養(yǎng)168 h后，將無菌組培苗根部侵入培養(yǎng)液中，靜置觀察；（2）木屑菌棒接種法：將無菌組培苗種植于裝有滅菌的木屑菌棒培養(yǎng)基質(zhì)的玻璃瓶中[8]，種植1周后，將培養(yǎng)168 h的橡膠靈芝菌菌絲體接種至木屑菌棒培養(yǎng)基質(zhì)中，培養(yǎng)觀察。每種方法3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用正交設(shè)計助手軟件對正交試驗所得數(shù)據(jù)進行分析，將其他數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅根菌液體培養(yǎng)生長曲線

從圖1的生長曲線中可以看出，該菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24～240 h，生物量逐步上升，其中在48～168 h期間生長快速，呈直線增長，后期生長緩慢，240 h時菌絲體生物量達到最高值（1.41 g/100 mL），之后開始下降。

2.2 培養(yǎng)基碳、氮源優(yōu)化

根據(jù)極差分析可知，7種碳、氮源對菌絲生長影響的大小依次為B>C>D>G>A>E=F，即葡萄糖>D-果糖>玉米粉>蛋白胨>蔗糖>酵母粉=黃豆粉（表2）。最佳組合配方是A1B2C2D1E3F2G3：蔗糖1%，葡萄糖2%，D-果糖2%，玉米粉0.5%，酵母粉0.5%，黃豆粉0.8%，蛋白胨1%。

2.3 培養(yǎng)溫度對菌絲體生物量的影響

圖2的結(jié)果表明，紅根菌菌絲體在低于25℃、高于31℃的培養(yǎng)環(huán)境下生長緩慢，最適生長溫度為29℃，該溫度下菌絲體生物量可達2.05 g/100mL。

2.4 菌種菌齡對菌絲體生物量的影響

6種菌齡的菌種經(jīng)接種培養(yǎng)后，菌絲體生物量差異不顯著，其中菌齡120 h的生物量略高于其他5個供試菌齡（圖3）。

2.5 液體培養(yǎng)的菌絲體致病性驗證結(jié)果

利用浸根接種法靜置接種10 d后，在培養(yǎng)液表面形成塊狀菌絲體并開始蔓延，逐漸侵染至組培苗根部，組培苗葉片開始黃化、萎蔫、脫落（圖4A）；靜置接種20 d，三角瓶培養(yǎng)液表面形成一整塊菌絲體，菌絲侵染組培苗根部形成白色的菌膜（圖4C）。利用木屑菌棒接種法接種20 d后，菌絲長滿玻璃瓶，組培苗葉片出現(xiàn)黃化、萎蔫和脫落的癥狀（圖4B）；接種30 d后，菌絲體侵染整個根部和部分根莖部，形成白色菌膜（圖4D）。

3 討論

本研究在前文報道橡膠樹紅根病病菌生物學(xué)特性[5]、其它擔(dān)子菌培養(yǎng)基[9-13]以及前期實驗基礎(chǔ)上，選擇適合橡膠樹紅根病病菌液體培養(yǎng)的碳氮源。通過正交試驗極差分析，3種碳源中葡萄糖對菌絲生長影響最大，D-果糖和蔗糖次之；4種氮源中玉米粉對菌絲生長影響最大，隨后依次是蛋白胨、酵母粉、黃豆粉。碳源的利用效率與前文報道略有不同，可能是固定培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)與液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)動培養(yǎng)這2種培養(yǎng)方式的差異所致。最后綜合得出了適合橡膠樹紅根病病菌液體培養(yǎng)的配方是：蔗糖1%，葡萄糖2%，D-果糖2%，玉米粉0.5%，酵母粉0.5%，黃豆粉0.8%，蛋白胨1%，KH2PO4 0.1%，MgSO4 0.1%，VB1 0.02%。本研究還對培養(yǎng)周期、培養(yǎng)溫度和菌種菌齡等幾個重要培養(yǎng)因素進行了單因素篩選，結(jié)果得出最適生長溫度為29℃，低于25℃、高于31℃菌絲生長緩慢；菌種菌齡對菌絲體生物量影響不顯著，其中菌齡120 h的菌絲體生物量達到最大值。由此確定最適合紅根病病菌液體培養(yǎng)的條件為：液體菌種菌齡120 h，培養(yǎng)溫度29℃，培養(yǎng)周期240 h。在以上培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，紅根病病菌菌絲體生物量最大可達2.11 g/（100 mL），遠高于固體培養(yǎng)所得到的菌絲體生物量。試驗表明，液體培養(yǎng)的菌絲體仍然具有較強的侵染力，橡膠靈芝液體培養(yǎng)的成功有利于紅根病接種鑒定方法的改良及橡膠樹紅根病抗性鑒定評價體系的建立。同時，橡膠靈芝在現(xiàn)有的培養(yǎng)條件下，生長速度較其他靈芝菌[14-15]緩慢。因此，后續(xù)的研究仍需要在現(xiàn)有的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，優(yōu)化相關(guān)的微量元素及營養(yǎng)元素含量，進一步提高橡膠靈芝液體培養(yǎng)效果。

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