基于轉(zhuǎn)錄調(diào)控模體的人不同組織基因差異性的統(tǒng)計(jì)分析

楊 敏，張 靜

(云南大學(xué)數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)院統(tǒng)計(jì)系，昆明650091)

基因表達(dá)是指基因在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯以及轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)分子之前的所有加工過(guò)程，基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控中最重要的過(guò)程，正確的轉(zhuǎn)錄調(diào)控使得整個(gè)生物體內(nèi)的能量和資源得以正確的分配［1］。由于調(diào)控元件(或稱模體)是一些具有保守性功能的片段，在基因的長(zhǎng)期進(jìn)化中具有不變的趨勢(shì)，因此可以從調(diào)控元件的角度來(lái)分析基因表達(dá)的差異性。不同組織所使用的調(diào)控元件既有相同的，也有不同的。可能幾個(gè)組織共同使用一些調(diào)控元件，也可能某個(gè)組織單獨(dú)使用一些調(diào)控元件。Yu［2］等人基于轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用，識(shí)別了人類30個(gè)組織特異性基因的調(diào)控模塊，開發(fā)并制作了TiGER數(shù)據(jù)庫(kù)［3］。用這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)可以方便地查詢各個(gè)組織的調(diào)控模塊，但是不同組織可能共同使用了一些調(diào)控元件，因此，還缺少各個(gè)組織所特有的調(diào)控元件信息，即對(duì)組織基因調(diào)控的差異性缺乏研究。本文利用傳統(tǒng)識(shí)別調(diào)控元件的方法［4］，并應(yīng)用泊松分布和主成分分析提取出各組織的調(diào)控元件，再基于這些調(diào)控元件，用統(tǒng)計(jì)方法統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)次數(shù)具有顯著性特征的特有模體，基于這些特有模體，尋找控制各組織基因調(diào)控的元件。

1 方法

1.1 提取過(guò)表達(dá)模體的方法

提取過(guò)表達(dá)模體的方法分為兩步:第一步是采用泊松分布計(jì)算出各個(gè)模體出現(xiàn)的概率;第二步是把模體作為變量，每個(gè)組織中的每條基因啟動(dòng)子序列作為實(shí)驗(yàn)條件，通過(guò)主成分分析，確定一組“主要模體”作為過(guò)表達(dá)模體。

1.1.1 泊松分布

van Helden提出泊松分布來(lái)比較兩條序列的相似性［5］。他認(rèn)為模體在某條基因序列上出現(xiàn)是服從泊松分布的，可用泊松分布來(lái)度量每個(gè)模體出現(xiàn)的概率。由于模體是一些具有保守性的功能片段，在基因的長(zhǎng)期進(jìn)化中具有不變的趨勢(shì)，因此通過(guò)泊松分布度量的每個(gè)模體出現(xiàn)的概率大小可以作為模體功能大小的估計(jì)。

為不同模體的出現(xiàn)打分，需要定義被考慮的模體在基因組中出現(xiàn)的概率。把每個(gè)組織的全部基因作為背景序列來(lái)計(jì)算背景頻率。頻率表示給定模體i在組織j中出現(xiàn)的頻率，表示模體i在組織j中出現(xiàn)次數(shù)的期望，L表示啟動(dòng)子序列的長(zhǎng)度。則有

模體i在第k條啟動(dòng)子序列上的出現(xiàn)次數(shù)服從泊松分布，泊松分布的分布函數(shù)F( x，)表示期望值為時(shí)，觀察到出現(xiàn)次數(shù)≤x的概率。定義第k條基因啟動(dòng)子序列上模體i至少出現(xiàn)次的概率為

采用MATLAB軟件編程即可得到每個(gè)模體在每條序列中出現(xiàn)的概率。

1.1.2 主成分分析PCA

主成分分析的主要思想是以某些線性組合(主成分)來(lái)表示原始數(shù)據(jù)，再?gòu)倪@些線性組合中盡快提取原始數(shù)據(jù)的信息［6］。給定n維空間中的m個(gè)點(diǎn)，尋求一個(gè) n×n維的矩陣 W，使得 Y=［y1，y2，…，ym］=WTX，同時(shí)滿足新坐標(biāo)系下各維之間數(shù)據(jù)的相關(guān)性最?。?］。

主成分分析的一般步驟為［8］:

假設(shè)數(shù)據(jù)為 X=［x1，x2，…，xi，…，xm］，維數(shù)為n，在下列所有運(yùn)算中均有 i∈[1，n]，j∈[1，m]。

(3)計(jì)算協(xié)方差矩陣 Sn×m，當(dāng) Pocc*Pd時(shí)，S［a，

(4)對(duì)協(xié)方差矩陣進(jìn)行特征分析，并將特征值由大到小排列:λ1＞λ2＞…＞λd，對(duì)應(yīng)的特征向量也作相應(yīng)排列。

(5)取前 d 個(gè)特征值∧d=diag［λ1，λ2，…λd］和特征向量 Wd=［w1，w2，…，wd］，主成分分析可以由X在Wd上投影得到，即:Y=，原始數(shù)據(jù)重建為:X=WY+。

(6)進(jìn)一步分析每個(gè)主成分對(duì)信息的貢獻(xiàn)，確定d。令 λi表示第 i(i=1，2，…，d)個(gè)特征值，定義第i個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率為則有前 r個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為一般要求累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到70%以上。

n個(gè)變量的m個(gè)觀察值，形成一個(gè)n×m的數(shù)據(jù)矩陣，n通常比較大。由于每個(gè)新變量是原有變量的線性組合，體現(xiàn)原有變量的綜合效果，具有一定的實(shí)際意義。采用PCA的方法提取過(guò)表達(dá)模體，把模體i作為變量，每個(gè)組織中的每條基因啟動(dòng)子序列作為實(shí)驗(yàn)條件，通過(guò)主成分分析，確定一組“主要模體”作為過(guò)表達(dá)模體。

1.2 不同組織基因調(diào)控模體使用的差異性分析

1.2.1 Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)

Wilcoxon秩和檢驗(yàn)［9］并不要求數(shù)據(jù)滿足某種分布假設(shè)且這種方法也非常適合小樣本數(shù)據(jù)集。根據(jù)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的大小排序，然后得到數(shù)據(jù)的秩，再利用數(shù)據(jù)的秩而不是數(shù)據(jù)本身計(jì)算基因的秩和統(tǒng)計(jì)量。Wilcoxon秩和檢驗(yàn)是一種建立在二項(xiàng)分布理論基礎(chǔ)上的總體分布位置差異非參數(shù)檢驗(yàn)方法。

設(shè) X1，…，Xm和 Y1，…，Yn是分別來(lái)自具有F( x－ μ1)和F( x－ μ2)連續(xù)分布形式的獨(dú)立總體的兩個(gè)隨機(jī)樣本，假設(shè)

將樣本X1，…，Xm和Y1，…，Ym混合在一起，并按從小到大的順序排列起來(lái)。每一個(gè)觀測(cè)值在混合排列中都有自已的秩。令Ri為Yi在這N=m+n個(gè)數(shù)中的秩(即Yi是第Ri小的)。令I(lǐng)m和In分別表示兩樣本的指標(biāo)集，則

同樣，對(duì)于X樣本也可以得到WX:

稱WY或WX為Wilcoxon秩和統(tǒng)計(jì)量。令

WXY表示在混合樣本中所有X的觀測(cè)值小于Y的觀測(cè)值的個(gè)數(shù)。則有

因此WXY(或WYX)也可作為上述檢驗(yàn)問(wèn)題的檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量，它們稱為Manm-Whitney統(tǒng)計(jì)量。當(dāng)WXY很小時(shí)可拒絕零假設(shè)。

當(dāng)m，n均較大時(shí)(大于10)，在H0假設(shè)下，可用正態(tài)分布近似。此時(shí)WXY漸近服從均值為，方差為的正態(tài)分布。因此可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布作檢驗(yàn)，其檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量為:

在許多情況下，數(shù)據(jù)中有相同的數(shù)字，稱為結(jié)(tie)。結(jié)中數(shù)字的秩為它們按升冪排列后位置的平均值。對(duì)于打結(jié)的情況，此時(shí)大樣本近似用的Z值應(yīng)修正為:

這里τi為結(jié)統(tǒng)計(jì)量，而t為結(jié)的個(gè)數(shù)。

對(duì)于顯著性水平α，當(dāng)p值＜α?xí)r，拒絕H0;否則不能拒絕。

1.2.2 基因表達(dá)的差異性分析

本文主要考慮不同組織所使用的調(diào)控元件的差異情況。具體做法是:把某個(gè)組織的過(guò)表達(dá)模體與其他與之有顯著性差異的所有組織的過(guò)表達(dá)模體相比，提取出那些在這個(gè)組織中出現(xiàn)，而在其他與之有顯著性差異的所有組織中不出現(xiàn)的模體作為測(cè)試集S。并統(tǒng)計(jì)出各個(gè)模體出現(xiàn)的次數(shù)。用超幾何分布(Hypergeometric distribution)計(jì)算模體在S中出現(xiàn)的概率:

其中N表示與這個(gè)組織有顯著性差異的組織個(gè)數(shù)，T表示某個(gè)模體mi在測(cè)試集S中出現(xiàn)的次數(shù)，把與這個(gè)組織有顯著性差異的組織分為兩類，一類是具有模體mi的組織，另一類是不具有模體mi的組織，前者組織個(gè)數(shù)記為N－n，后者記為n。pt值越小，說(shuō)明模體mi是某個(gè)組織特有的模體的可能性越大。設(shè)定閾值b，當(dāng)pt＜b時(shí)，認(rèn)為模體mi在測(cè)試集S中出現(xiàn)的頻率顯著高于其他模體的出現(xiàn)頻率，稱模體mi是這個(gè)組織的特有模體。然后分析這些特有模體的特征，并分析它們?cè)趩?dòng)子序列中出現(xiàn)的位置，以此為基礎(chǔ)分析各組織使用的模體參與情況。

2 樣本和啟動(dòng)子序列的選取

2.1 樣本

本文樣本包括人的HK(管家)基因以及30組TSP(組織特異性)基因。人HK基因序列數(shù)據(jù)從HuGEIndex數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得。該數(shù)據(jù)庫(kù)給出了451條HK基因的id，剔除無(wú)內(nèi)含子和線粒體中的基因，共得到412條HK基因啟動(dòng)子序列。30組TSP基因，來(lái)自Yu等［2］文獻(xiàn)中采用聚類方法所得。根據(jù)文獻(xiàn)中分析得到的30個(gè)組織特異性基因的id號(hào)，從UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)提取人30個(gè)組織特異性基因的基因序列(見表1)。

表1 各組織的基因條數(shù)Table 1 Number of genes in each tissues

2.2 啟動(dòng)子序列的選取

研究表明，基因上游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)一般位于翻譯起始位點(diǎn)(ATG)上游1 000 bp區(qū)域內(nèi)，目前大部分工作主要集中在基因上游區(qū)域。因此采取基因上游1 000 bp區(qū)域作為啟動(dòng)子序列。在下載的7 261條基因序列中剔除啟動(dòng)子序列相同的基因序列，共得到4 672條啟動(dòng)子序列。本文主要考察6核苷酸。

3 潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模體

3.1 提取過(guò)表達(dá)模體

其中 mi(i=1，2，…，4 096)表示模體，gj(j=1，2，…，t)表示組織中的基因啟動(dòng)子序列。為了消除概率很小甚至為零的數(shù)據(jù)的不利影響，對(duì)4 096個(gè)模體的出現(xiàn)概率進(jìn)行加權(quán)平均，即對(duì)于模體mi，在組織中出現(xiàn)的概率為:

其中nij(j=1，2，…，t)表示模體i在第j條基因序列上出現(xiàn)的數(shù)目，Ni表示模體i在這個(gè)組織中出現(xiàn)的數(shù)目，且有Ni=ni1+ni2+…+nit。

本文提取出現(xiàn)率 pocc=1－p′i＜0.05的模體進(jìn)行主成分分析，取累計(jì)貢獻(xiàn)率在70%以上的模體，作為過(guò)表達(dá)模體，各個(gè)組織中提取的過(guò)表達(dá)模體數(shù)目見表2。

表2 各組織中應(yīng)用PCA提取的過(guò)表達(dá)模體數(shù)目Table 2 Number of over-represented motifs extracted by principal components analysis

提取出的過(guò)表達(dá)模體的準(zhǔn)確率，可以通過(guò)與TRANSFAC數(shù)據(jù)庫(kù)［10］進(jìn)行比對(duì)。模體識(shí)別準(zhǔn)確率的計(jì)算為識(shí)別正確的模體的個(gè)數(shù)除以提取的過(guò)表達(dá)模體的個(gè)數(shù)。通過(guò)搜集整理得到TRANSFAC數(shù)據(jù)庫(kù)中人的213個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。與TRANSFAC數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，準(zhǔn)確率最低是87.50%，最高可達(dá)到95.98%(表3)，說(shuō)明提取出的過(guò)表達(dá)模體具有生物學(xué)上的意義。

表3 各組織的過(guò)表達(dá)模體與TRANSFAC數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的情況Table 3 Comparison of over-represented motifs with TRANSFAC database

3.2 過(guò)表達(dá)模體的特征分析

針對(duì)過(guò)表達(dá)模體中堿基的出現(xiàn)情況，將模體進(jìn)行適當(dāng)分類［11］。如果6核苷酸中有4個(gè)或4個(gè)以上的堿基是A或T，認(rèn)為該6核苷酸富含A、T，稱為AT_rich模體;同樣如果6核苷酸中有4個(gè)或4個(gè)以上的堿基是C或G，認(rèn)為該6核苷酸富含 C、G，稱為CG_rich模體;其它既非AT_rich模體又非CG_rich模體，稱為CG/AT_lack模體。

HK基因啟動(dòng)子中堿基A+T含量和C+G含量分別為52%和48%，即在HK基因啟動(dòng)子序列中，A+T含量較高。提取出的過(guò)表達(dá)模體中富含A、T的模體比率高于富含C、G模體的比率。各組織的過(guò)表達(dá)模體特征見表4。

表4 各組織中模體的堿基使用情況Table 4 Base usage of motifs in each tissues

把上表做成圖形以便于更直觀的觀察(見圖1)。

圖1 各組織中各富含模體的比率Fig.1 The rate of rich motifs in each tissues

從上圖知，各個(gè)組織的調(diào)控元件中CG/AT_lack模體比率大致相同，而AT_rich模體、CG_rich模體比率變化大，說(shuō)明其主要差異在于AT_rich模體、CG_rich模體。雖然CG/AT_lack模體在各個(gè)組織中的比重都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于AT_rich模體、CG_rich模體，但在各個(gè)組織中基本都出現(xiàn)，而在各個(gè)組織中AT_rich模體、CG_rich模體出現(xiàn)不盡相同。由此可以推測(cè)控制基因表達(dá)差異性的元件是AT_rich模體或CG_rich模體。從以上分析可以看出，HK基因的調(diào)控模體中AT_rich模體的比率高于CG_rich模體比率，而大部分TSP基因(除骨、大腦、宮頸、卵巢、胃、胸腺、舌頭外)的調(diào)控模體中CG_rich模體的比率高于AT_rich模體的比率。由此可以推測(cè)HK基因和TSP基因的調(diào)控元件特征不同。即HK基因的調(diào)控元件偏向AT_rich模體，而 TSP基因的調(diào)控元件偏向CG_rich模體。

4 各組織調(diào)控元件使用的差異性分析

一個(gè)組織的表現(xiàn)形式不同于另一個(gè)組織，雖然是由眾多的因素造成，但是否與每個(gè)組織自身特有的調(diào)控元件有關(guān)呢?為此我們考查了不同組織組織調(diào)控元件使用的差異性情況。

4.1 組織間調(diào)控元件的顯著性差異結(jié)果

計(jì)算每?jī)蓚€(gè)組織調(diào)控元件的Z統(tǒng)計(jì)量，并根據(jù)此統(tǒng)計(jì)量檢驗(yàn)每?jī)蓚€(gè)組織的調(diào)控元件是否具有顯著性差異。結(jié)果顯示，除組織次級(jí)神經(jīng)系統(tǒng)、睪丸的調(diào)控元件與HK基因的調(diào)控元件不能判斷具有顯著性差異外，其他TSP基因的調(diào)控元件都與HK基因的調(diào)控元件具有顯著性差異。

4.2 調(diào)控元件的差異性分析

以HK基因?yàn)槔?，HK基因與除次級(jí)神經(jīng)系統(tǒng)、睪丸這兩個(gè)組織的其他28個(gè)組織都具有顯著性差異，而通過(guò)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn) ATTTCG、GGCATA、GGTATA、GTATAG、TATAGT和TATGAC這6個(gè)模體在測(cè)試集S中都出現(xiàn)了28次，說(shuō)明這6個(gè)模體與在其他28個(gè)組織中都不出現(xiàn)的，而只出現(xiàn)在HK基因中，因此，我們可以推測(cè)這6個(gè)模體很可能是HK基因的特有調(diào)控元件。這6個(gè)模體所對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子是HTF。再分析這6個(gè)模體，發(fā)現(xiàn)它們中有5個(gè)是AT_rich模體。若把啟動(dòng)子序列分為五個(gè)區(qū)域:0～200 bp、200～400 bp、400～600 bp、600～800 bp和 800～1 000 bp。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，這六個(gè)模體在啟動(dòng)子序列上的分布情況如下:

表5 HK基因中特有模體在啟動(dòng)子序列上的位置分布Table 5 Location of specific motifs in the promoter sequences of HK genes

由上表知，特有模體的位置分布也具有一定的偏向性，在0～200 bp上分布最密集，其次在400～600 bp上也有分布，而其他序列區(qū)域里則分布得少，甚至沒(méi)有。

對(duì)每個(gè)組織仿效HK基因，對(duì)得到的測(cè)試集進(jìn)行分析并確定這個(gè)組織的特有模體。結(jié)果顯示各個(gè)組織的特有模體大部分都不相同，其中不乏共同使用特有模體的。如腎臟與小腸共同使用特有模體CGCATG，這也能從一個(gè)側(cè)面得到證實(shí):腎臟和小腸［12］都具有消化功能。膀胱與子宮共同使用特有模體CCGACG，有臨床試驗(yàn)表明:子宮切除術(shù)后，由于支配膀胱的神經(jīng)損傷和膀胱解剖位置的改變，常常引起膀胱功能的障礙［13］。再如肌肉、骨髓與腎臟共同使用特有模體GCGCTA，這是由于體內(nèi)肌肉組織代謝產(chǎn)物肌酐，經(jīng)血循環(huán)到達(dá)腎臟，從腎小球?yàn)V過(guò)后從尿中排泄，因此可以通過(guò)測(cè)定血清肌酐濃度判斷腎小球?yàn)V過(guò)功能。同時(shí)，腎臟分泌促進(jìn)紅細(xì)胞生成素，促進(jìn)骨髓造血，生成紅細(xì)胞。各組織特有模體的模體特征都偏向于AT_rich模體或CG_rich模體。

5 結(jié)語(yǔ)

本文用簡(jiǎn)單易行的方法提取出各個(gè)組織的調(diào)控元件及特有模體。結(jié)果顯示，在管家基因和30個(gè)組織特異性基因中，它們的調(diào)控元件都具有一定的偏向性，偏向于AT_rich模體或CG_rich模體，而具有CG/AT_lack模體特征的調(diào)控元件是極少的。由調(diào)控元件的這一偏向規(guī)律，在今后的調(diào)控元件識(shí)別中可以首先忽略CG/AT_lack模體，從而為識(shí)別過(guò)程縮小了范圍。分析發(fā)現(xiàn)各組織之間有共同使用的調(diào)控元件，例如管家基因和眼睛，其調(diào)控元件個(gè)數(shù)分別為126和132，他們共同使用的調(diào)控元件個(gè)數(shù)為55。然而各個(gè)組織也有不少自己?jiǎn)为?dú)使用的調(diào)控元件即特有模體，這些特有模體專職調(diào)控這些組織的基因表達(dá)，模體特征都偏向于AT_rich模體或CG_rich模體，與過(guò)表達(dá)模體的偏向是一致的。由此可推測(cè)，特有模體控制著各組織基因的表達(dá)。本文的工作對(duì)于掌握人基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制和調(diào)控模體的作用具有一定的指導(dǎo)意義。

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