利用體外瘤胃發(fā)酵法研究全株玉米青貯與花生蔓和羊草間的組合效應

孫國強，呂永艷，張杰杰

（青島農業(yè)大學動物科技學院，山東 青島266109）

為奶牛組織飼糧時，要求日糧組成多樣化、科學搭配和適口性強。利用飼料間的組合效應進行飼草飼料的科學搭配可以提高飼草利用率、降低飼養(yǎng)成本和提高奶牛生產的經濟效益。早在19世紀末，德國學者就已發(fā)現(xiàn)日糧內部存在相互之間的組合效應（associative effects），比如草食家畜日糧中的淀粉過多，則會使干草的消化率降低［1］。1931年，首次有學者提出了混合飼料的非加性效應（non-additive effects）或組合效應，也有學者報道用不同飼料組成的飼糧飼喂反芻動物時，飼糧的表觀消化率必定不等于各個飼料的表現(xiàn)消化率的加權值之和［2］。Mould等［3］以飼糧中可利用能值或消化率的實測值與各飼料組分加權估算值之間的差異作為衡量飼料間組合效應的唯一指標，這種對飼料間組合效應的理解局限于“非加性”的概念。隨著飼料能量評價體系的研究的深入，組合效應越來越被各國營養(yǎng)學家和學者所普遍關注，特別是對反芻動物飼料間組合效應的存在予以廣泛認同［4］。目前用于衡量組合效應的指標，主要是包括能量在內的所有營養(yǎng)物質的各種利用率指標和動物對飼糧或飼糧中某種飼料的采食量。由于產氣量與營養(yǎng)物質的消化率高度相關［5］，且體外產氣技術簡便易行，因此，目前多用體外產氣法研究飼料的組合效應［6-9］。王旭［10］采用體外法研究了粗飼料混合后的組合效應，并首次運用了多項組合效應指數（multiple-factors associative effects index，MFAEI），該指數綜合了產氣量、有機物消化率、揮發(fā)性脂肪酸、微生物蛋白質等多項指標。高靜等［1］以飼草的營養(yǎng)評價為基礎，采用體外法，測定苜蓿、番茄皮渣、玉米秸與小麥秸不同組合的p H值、24 h累積產氣量、有機物質降解率、微生物蛋白產生量、揮發(fā)性脂肪酸產量，利用組合效應綜合指數（即多項組合效應指數）篩選出4組最優(yōu)飼草配方。玉米青貯是奶牛重要的粗飼料來源，也是發(fā)展我國奶業(yè)的支撐，全株玉米青貯（whole corn silage）更以營養(yǎng)價值高、保存效果好等優(yōu)點，得以在奶牛生產中大量使用［11］。有大量關于全株玉米青貯的制作方法及其對奶牛營養(yǎng)價值及飼喂效果的研究報道。羊草（Leymus chinensis）是優(yōu)良的天然草地植物，廣泛分布于我國東北、內蒙古和西北地區(qū)［12］。羊草兼具重要的經濟價值和生態(tài)價值［13］，其經濟價值就是羊草對草食動物特別是反芻動物的營養(yǎng)作用，關于羊草對奶牛的營養(yǎng)作用國內外已經進行了很多研究。也見有少量關于花生蔓（peanut vine）在奶牛生產中應用的報道。迄今，尚未見在奶牛日糧中全株玉米青貯與花生蔓和羊草3種粗飼料適宜配合比例的報道。本試驗利用體外法，研究奶牛日糧中全株玉米青貯與花生蔓及羊草間的組合效應，旨在探討3種粗飼料間的適宜配合比例，為正確進行奶牛日糧中粗飼料搭配提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2013年在青島農業(yè)大學動物營養(yǎng)實驗室進行。全株玉米青貯（whole corn silage，WCS）、花生蔓（peanut vine，PV）和羊草（L.chinensis，LC），均來自青島同一奶牛場。制成風干樣品粉碎過0.42 mm篩，然后烘干至恒重備用。經測定3種粗飼料營養(yǎng)成分見表1。

表1 全株玉米青貯、花生蔓和羊草的營養(yǎng)成分（干物質基礎）Table 1 The nutrient composition of whole corn silage，peanut vine and L.chinensis（dry matter basis） %

1.2 試驗用瘤胃液供體動物與日糧

選用2頭健康、體重相近的成年荷斯坦奶牛作為試驗用瘤胃液供體動物。試驗期間每天每頭飼喂精料4 kg，苜蓿干草與花生蔓各2 kg，分3次飼喂，羊草自由采食，自由飲水。精料組成及營養(yǎng)水平見表2。

1.3 試驗設計

將全株玉米青貯與花生蔓以100∶0，90∶10，80∶20，70∶30，60∶40，50∶50，40∶60，30∶70，20∶80，10∶90，0∶100的比例進行組合（表3）；篩選出全株玉米青貯與花生蔓的最優(yōu)組合后再與羊草以這11個比例進行組合（表3）。每個組合3個重復。

1.4 人工瘤胃

1.4.1 人工瘤胃裝置 人工瘤胃裝置主體為恒溫水浴搖床，水浴溫度和振蕩頻率可調；培養(yǎng)管，其管口安裝帶有放氣閥（只能放氣而不能進氣）的橡皮塞，培養(yǎng)管用來測體外瘤胃干物質消化率；同時用玻璃注射器（可計量容積為100 m L）作發(fā)酵培養(yǎng)管用來測定產氣量和微生物蛋白產量，注射器每次使用之前洗凈晾干，然后用少量凡士林涂在活塞筒四周，以減少摩擦和防止漏氣［14］。

表2 精飼料組成及其營養(yǎng)水平（風干基礎）Table 2 Composition and nutrient levels of the concentrate（air dry basis）

表3 飼料間的組合比例Table 3 Combination proportions of food stuff

1.4.2 培養(yǎng)液的制備 培養(yǎng)液的制備參照郭冬生［15］的方法進行。

1.4.3 瘤胃液的采集 在早晨飼喂前抽取瘤胃液。令牛站立將其保定于六柱欄，戴上開口器，取液器從開口器經口腔徐徐插入食道再進入瘤胃，在瘤胃中不斷變換方位，取液器另一端與真空抽濾瓶相連，真空抽濾瓶接真空泵，開動真空泵抽取足量瘤胃液，灌入經預熱達39℃并通有CO2氣體的保溫瓶中，立即蓋嚴瓶口，迅速返回實驗室，2頭牛的瘤胃液混合，經4層紗布過濾于接收瓶中，置于39℃水浴中保存，持續(xù)通入CO2氣體。

1.4.4 人工瘤胃液的制備 將250 m L預先配制好并在39℃水浴中預熱的培養(yǎng)液與1000 m L在39℃水浴中預熱的蒸餾水混合之后再加入312.5 m L過濾后并持續(xù)通入CO2氣體的瘤胃液，混合，攪拌均勻后置于39℃恒溫水浴鍋中保存，人工瘤胃液始終用CO2氣體飽和，待用。

1.5 測定指標與方法

本試驗采用人工瘤胃技術，根據發(fā)酵24 h的產氣量（gas production，GP）、瘤胃干物質降解率（dry matter digestibility，DMD）和微生物蛋白產量（microbial protein，MCP）三項指標來計算飼料間的組合效應。在進行批次培養(yǎng)時每個樣品設3個重復，另設置3個空白樣品，分別排列于培養(yǎng)框架的前位與后位，以消除試驗誤差。

1.5.1 產氣量（GP）的測定 參照蘇海涯［6］的產氣量測定方法進行產氣量的測定，將產氣量換算成每g飼料干物質產氣的m L數（m L／g DM）。

1.5.2 體外瘤胃干物質降解率的測定 稱取飼料風干樣品0.5 g，裝入濾袋（特制無紡布小袋，中國農業(yè)大學肉牛研究中心專利產品）中，熱封口機封口，置于玻璃培養(yǎng)管中，每根管可放3個濾袋，取60 m L始終用CO2氣體飽和的人工瘤胃液加到每一個玻璃培養(yǎng)管中，迅速蓋好橡膠塞，然后在39℃的恒溫水浴搖床中培養(yǎng)24 h，每個樣品3個重復。同時另設置3個空白濾袋，分別排列于培養(yǎng)框架的前位與后位，以消除試驗誤差。經過24 h培養(yǎng)，取出濾袋，迅速用冷水沖洗，以終止微生物發(fā)酵，移入已知重量的多孔坩堝中。將坩堝送入干燥箱，105℃烘干至恒重。

1.5.3 微生物蛋白產量的測定 菌體蛋白質分離采用差速離心法。參照Cotta和Russeiil［16］闡述的方法。

1.5.4 單項和多項組合效應指數的計算 單項組合效應指數（single-factors associative effects index，SFAEI）的計算：

式中，實測值為樣品某一指標實測值；加權估算值＝A飼料某一指標實測值×A飼料配比（%）＋B飼料某一指標實測值×B飼料配比（%）。

多項組合效應指數（multiple-factors associative effects index，MFAEI）的計算：

1.6 數據處理

采用SPSS 17.0軟件的一般線性模型（GLM）程序進行方差分析和Duncan氏多重比較，對組合效應值進行t檢驗。

2 結果與分析

2.1 全株玉米青貯與花生蔓不同比例組合的24 h產氣量及其組合效應

表4顯示了全株玉米青貯（WCS）與花生蔓（PV）不同組合的產氣量，可以看出，隨著PV比例從10%增加到30%，產氣量逐漸增加，PV比例占30%時產氣量達到最高，然后隨PV比例的增加，產氣量逐漸減少，產氣量呈先增加后減少的變化規(guī)律，單一PV的產氣量要高于單一WCS的產氣量。在組合效應上，WCS比例為90%到50%的組合均產生了顯著的正組合效應（P＜0.05），其中WCS比例為70%的組合產生的正組合效應極顯著高于其他比例的組合效應（P＜0.01），達到了0.69。WCS比例為40%的組合產生了不顯著的零組合效應（P＞0.05），WCS比例為30%的組合產生了不顯著的負組合效應（P＞0.05），WCS比例為20%和10%的組合產生了顯著的負組合效應（P＜0.05）。

表4 全株玉米青貯與花生蔓組合的產氣量及組合效應值Table 4 The gas production（GP）and associative effects（AEGP）of WCS and PV mixtures

2.2 全株玉米青貯與花生蔓不同比例組合的24 h微生物蛋白產量、瘤胃干物質降解率及其組合效應

由表5可以看出，除PV比例為10%～20%的組合外，微生物蛋白產量隨著PV比例的增加而增加，單一花生蔓的MCP高于單一全株玉米青貯。根據MCP計算各組合效應，WCS與PV不同比例的組合均產生了負組合效應，其中PV比例為10%～40%的組合顯著高于比例為50%的組合（P＜0.05），而與比例為60%～90%的組合間無顯著差異（P＞0.05），比例為50%的組合與比例為60%～90%的組合間無顯著差異（P＞0.05）。按照MCP組合效應排序的結果與按照產氣量組合效應排序的結果差異很大。根據干物質降解率計算各組合效應，WCS比例為10%～30%的組合均產生了顯著的負組合效應（P＜0.05），WCS比例為40%～90%的組合均產生了正組合效應，且除比例為40%的組合產生正組合效應的趨勢外（P＞0.05），均產生了顯著的正組合效應（P＜0.05），用DMD組合效應評價 WCS與PV不同比例的組合產生的正組合效應表明，最大正組合效應出現(xiàn)在WCS比例為70%的組合，按照DMD組合效應排序的結果與按照產氣量組合效應排序的結果是完全一致的。

用3個單一指標計算的組合效應結果不完全一致，因此要通過多項組合效應指數（表6）評價。表6說明，全株玉米青貯與花生蔓不同組合的多項組合效應指數評價結果和產氣量組合效應評價結果一致，WCS∶PV＝70∶30的組合其多項組合效應指數最大。

表5 全株玉米青貯與花生蔓組合的24 h微生物蛋白產量、瘤胃干物質降解率及其組合效應值Table 5 The MCP production，DMD and associative effects of WCS and PV mixtures

表6 全株玉米青貯與花生蔓組合的多項組合效應指數Table 6 The multiple-factors associative effects index for WCS and PV mixtures

2.3 全株玉米青貯花生蔓最優(yōu)組合與羊草不同比例組合的24 h產氣量及其組合效應

表7顯示了全株玉米青貯花生蔓最優(yōu)組合（BWP）與羊草不同比例組合24 h產氣量在BWP所占比例為80%時達到最高，之后逐漸減?。籅WP產氣量高于單一羊草；在24 h產氣量組合效應上，BWP比例為70%～90%的組合均產生了正組合效應，其中比例為70%～80%的組合產生了顯著的正組合效應（P＜0.05），而比例為80%的組合所產生的組合效應最大（P＜0.01），從BWP比例為60%之后的組合均產生了負組合效應，其中比例為10%～30%的組合均產生了顯著的負組合效應（P＜0.05），但10%～60%的6個比例的組合間差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 全株玉米青貯花生蔓最優(yōu)組合與羊草不同比例組合的24 h微生物蛋白產量、干物質降解率及其組合效應

由表8可知，在BWP與羊草的不同比例組合中，24 h微生物蛋白產量隨著羊草比例的增大而逐漸減小，且所有比例的組合均為負組合效應；在干物質降解率及其組合效應上，以BWP比例為80%時最高，之后隨著BWP比例的減小而降低，當比例降至60%時表現(xiàn)出零組合效應，比例為50%時則轉為負組合效應，且隨著BWP比例的降低，其負組合效應值出現(xiàn)增大的趨勢（P＞0.05），按照干物質降解率組合效應排序的結果與按照產氣量組合效應排序的結果盡管不完全相同，但是由于從比例為60%到10%的組合間其干物質降解率組合效應無顯著差異（P＞0.05），因此，實際上其排序是沒有區(qū)別的。

由表9可以看出，BWP與羊草不同比例的組合其多項組合效應指數評價結果與產氣量組合效應評價結果是一致的，BWP∶LC＝80∶20，即WCS∶PV∶LC＝56∶24∶20的組合其多項組合效應指數最大。

表7 全株玉米青貯花生蔓最優(yōu)組合與羊草不同比例組合的24 h產氣量及其組合效應值Table 7 The gas production and associative effects of BWP and LC mixtures

表8 全株玉米青貯花生蔓最優(yōu)組合與羊草不同比例組合的微生物蛋白產量、干物質降解率及其組合效應值Table 8 The MCP production，DMD and associative effects of BWP and LC mixtures

表9 全株玉米青貯花生蔓最優(yōu)組合與羊草不同比例組合的多項組合效應指數Table 9 The multiple-factors associative effects index for BWP and LC mixtures

3 討論

3.1 全株玉米青貯與花生蔓不同比例組合的24 h產氣量及其組合效應

產氣量是一個反映飼料總體可發(fā)酵程度的指標，取決于可發(fā)酵有機物含量和瘤胃微生物活力。有機物可發(fā)酵程度越大，瘤胃微生物活力越高，產氣量就越大。反之，飼料中的可發(fā)酵有機物含量越少，瘤胃微生物活力越弱，產氣量也相應越少?？砂l(fā)酵有機物含量取決于飼料特性，而瘤胃微生物活力即瘤胃微生物對有機物的分解能力在很大程度上取決于瘤胃能氮平衡，也就是瘤胃中碳水化合物的發(fā)酵和蛋白降解速率的同步及協(xié)調程度決定了底物的消化率和蛋白的利用率。由表4可知，全株玉米青貯與花生蔓比例為70∶30的組合其產氣量組合效應最大，而后產氣量組合效應逐漸下降，這與于騰飛等［17］的比例為80∶20的組合產氣量組合效應最大的結果不一致，其原因可能是于騰飛等［17］的組合比例梯度為20%，而本試驗的組合比例梯度為10%。花生蔓粗蛋白含量高，而全株玉米青貯碳水化合物易于發(fā)酵，當達到全株玉米與花生蔓比例為70∶30的組合時，能氮平衡和可發(fā)酵程度達到最佳狀態(tài)。

3.2 全株玉米青貯與花生蔓不同比例組合的24 h微生物蛋白產量、干物質降解率及其組合效應

微生物蛋白產量受很多因素的影響，各種營養(yǎng)物質的供應，包括碳水化合物、蛋白質（氮源）、維生素、常量元素及微量元素等都要保證，但維持微生物生長最主要的營養(yǎng)物質是碳水化合物和蛋白質（氮源）［8］。本試驗微生物蛋白產量及其組合效應的排序之所以與產氣量及其組合效應相反，其原因是飼料的產氣量主要與碳水化合物的消化高度相關，飼料蛋白質含量越高，產氣量反而越低［18］。

本試驗體外瘤胃干物質降解率組合效應與產氣量組合效應的排序是一致的，這與唐賽勇和張永根［8］的研究結果相同。劉太宇和郭孝［19］研究發(fā)現(xiàn)在玉米青貯中添加15%的花生蔓效果最為理想，本試驗結果與之差異較大，可能是本試驗采用全株玉米青貯之故。同一比例組合的干物質降解率組合效應略高于產氣量組合效應，分析原因可能是飼料的產氣量主要與碳水化合物的消化高度相關，而干物質則不僅包括碳水化合物還包括蛋白質等產氣量較少的營養(yǎng)物質。

由于用不同的指標計算所得的組合效應排序不一致，因此不能只用單項組合效應指數而要用多項組合效應指數進行飼料間組合效應的評價。

3.3 全株玉米青貯花生蔓最優(yōu)組合與羊草不同比例組合的產氣量、微生物蛋白產量、干物質降解率及其組合效應

全株玉米青貯－花生蔓的最優(yōu)組合再與羊草各比例組合的24 h產氣量、微生物蛋白產量、瘤胃干物質降解率及其組合效應與全株玉米青貯－花生蔓2種單一粗飼料以相同比例進行的組合有較大差異，其原因除了PV與LC兩種粗飼料營養(yǎng)特性的差異外，還可能與最優(yōu)組合的粗飼料與單一粗飼料之間即全株玉米青貯花生蔓以最優(yōu)組合而成的混合粗飼料與單一的全株玉米青貯之間在營養(yǎng)特性等方面的差異有關，也可能有其他尚不清楚的原因，有待于進一步探討。

綜上，在全株玉米青貯、花生蔓及羊草間不同比例的組合中，微生物蛋白產量較高時，相應的產氣量和瘤胃干物質降解率反而較低；反之，微生物蛋白產量較低時，相應的產氣量和干物質降解率反而較高，由此看來瘤胃微生物蛋白產量與瘤胃微生物活力有時會不一致，瘤胃微生物活力主要取決于分解有機物的酶活，而酶活是否與不同的飼料組合及不同飼料所含的微量元素等成分有關還是存在其他因素的影響需要進一步研究。

4 結論

在本試驗設計條件下，下列比例的組合其多項組合效應指數最大：1）全株玉米青貯與花生蔓以70∶30的比例組合；2）全株玉米青貯花生蔓的最優(yōu)組合與羊草以80∶20的比例組合，即全株玉米青貯∶花生蔓∶羊草＝56∶24∶20。