金屬硫蛋白對(duì)熱應(yīng)激下體外培養(yǎng)奶牛淋巴細(xì)胞的影響

占今舜，吳力專 ，李麗立，張彬*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410128；2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州225009；3.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所動(dòng)物生態(tài)營(yíng)養(yǎng)與健康養(yǎng)殖聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)生態(tài)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙410125）

金屬硫蛋白（metallothionein，MT）是在1957年研究金屬鎘的生物學(xué)作用時(shí)，從馬腎中分離出的一類具有分子量低、高巰基且具有與金屬離子結(jié)合的獨(dú)特性能的蛋白質(zhì)。它含有大量的半胱氨酸殘基（18～20個(gè)），少量或不含芳香族氨基酸和組氨酸，能被金屬元素誘導(dǎo)和結(jié)合多個(gè)金屬原子［1-4］?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，MT能夠通過提高奶牛體內(nèi)的過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物（GSH-Px）基因的表達(dá)來提高奶牛的抗熱應(yīng)激［5-7］。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是在活體內(nèi)取出與試驗(yàn)相關(guān)組織或細(xì)胞，在體外模擬體內(nèi)生理環(huán)境，且建立無菌、適溫和一定的營(yíng)養(yǎng)條件，使細(xì)胞生長(zhǎng)和生存并維持其結(jié)構(gòu)與功能的一種方法。該方法具有易于提供性狀相似的試驗(yàn)對(duì)象和耗資少，如對(duì)于大型經(jīng)濟(jì)動(dòng)物來講比較經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，被廣泛用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來研究MT對(duì)奶牛淋巴細(xì)胞的影響還尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)研究在熱應(yīng)激條件下，外源MT對(duì)體外培養(yǎng)的奶牛淋巴細(xì)胞的影響，目的是從細(xì)胞水平研究MT對(duì)奶牛的影響，豐富相關(guān)理論的研究，為推廣MT在奶牛業(yè)上的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 MT的來源 采用本實(shí)驗(yàn)室2012年7月誘導(dǎo)合成、分離和純化的奶牛肝臟鋅金屬硫蛋白（Zn-MT）［8］。

1.1.2 奶牛淋巴細(xì)胞的來源 從湖南省畜牧所購(gòu)買出生1 d的荷斯坦公奶牛，然后進(jìn)行屠宰。在無菌條件下取出脾臟放入經(jīng)過高溫滅菌過的PBS（phosphate buffer saline）溶液中。利用無菌的剪刀剪碎脾臟，去掉精膜和脂肪，將其置入胰消化酶中，在恒溫氣浴鍋中37℃，振蕩30 min，將組織倒入細(xì)胞網(wǎng)篩，用無菌的注射器芯對(duì)其碾壓、過濾，后將濾液輕輕加入裝有牛淋巴分離液的離心管中，1500 r／min，20 min離心，取離心后的第2層乳白色的淋巴細(xì)胞層，然后加入4 m L的RPMI 1640進(jìn)行1500 r／min，15 min洗滌2次，最終得到淋巴細(xì)胞，然后用完全培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 淋巴細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察

1.2.1 倒置顯微鏡觀察凋亡形態(tài) 將提取出來的奶牛淋巴細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋成5×105個(gè)／m L，隨機(jī)分為4組，每組細(xì)胞培養(yǎng)液中 MT的終濃度分別為0μg／m L（對(duì)照組）、70μg／m L（第Ⅰ組）、140μg／m L（第Ⅱ組）、210μg／m L（第Ⅲ組），同時(shí)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng)20 h，之后同時(shí)置于43℃水浴鍋中進(jìn)行熱應(yīng)激處理1 h，再回細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，收集每組的細(xì)胞在倒置顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察。

1.2.2 AO／EB染色觀察 取處理過的細(xì)胞，調(diào)整為5×105個(gè)／m L，收集細(xì)胞，然后在98μL的細(xì)胞懸液中加入2μL的AO／EB熒光染色液，用漩渦混合器將其混勻。用移液槍吸取該液體，將其加在載玻片上，蓋上蓋玻片后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3 淋巴細(xì)胞內(nèi)抗氧化指標(biāo)的檢測(cè)

檢測(cè)方法和步驟按照試劑盒上的說明書進(jìn)行，試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.4 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的檢測(cè)

1.4.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank登錄序列，以β-actin m RNA作為內(nèi)參，Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)結(jié)果見表1。引物的合成由上海生物工程股份有限公司完成。

1.4.2 cDNA的合成 根據(jù)所購(gòu)買的Revert AidTMFirst Strand cDNA Systhesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的說明書進(jìn)行操作。

1.4.3 RT－PCR反應(yīng)液和反應(yīng)條件 按表2配制PCR反應(yīng)液（操作請(qǐng)?jiān)诒线M(jìn)行）。

表1 引物設(shè)計(jì)Table 1 Primer design

1.4.4 數(shù)據(jù)的處理 采用Excel軟件進(jìn)行初步處理，然后用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用LSD方法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 淋巴細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

圖1 淋巴細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果Fig.1 Effects of morphological observation on lymphocyte1：對(duì)照組Control group；2：試驗(yàn)Ⅰ組Experimental groupⅠ；3：試驗(yàn)Ⅱ組Experimental groupⅡ；4：試驗(yàn)Ⅲ組Experimental groupⅢ.下同The same below.

圖2 AO／EB染色觀察結(jié)果Fig.2 Effects of staining on AO／EB

在倒置顯微鏡下觀察（圖1），正常的淋巴細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)并邊緣整齊，細(xì)胞呈圓形或橢圓形。而本試驗(yàn)結(jié)果為奶牛淋巴細(xì)胞在43℃熱應(yīng)激下，各組奶牛淋巴細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)的明亮度下降，細(xì)胞膜不完整，界限模糊并增強(qiáng)顆粒感，以及細(xì)胞腫脹、碎片。說明熱應(yīng)激能夠?qū)е履膛Ａ馨图?xì)胞凋亡和死亡。對(duì)照組中細(xì)胞腫脹數(shù)量和碎片均多于試驗(yàn)Ⅰ～Ⅲ組，試驗(yàn)Ⅰ～Ⅲ組細(xì)胞腫脹數(shù)量和細(xì)胞碎片逐漸增多，且第Ⅰ組最少。說明在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加低濃度MT可以有效緩解熱應(yīng)激對(duì)奶牛淋巴細(xì)胞的損傷。但隨MT濃度的增加，其緩解作用效果下降。

2.2 AO／EB染色觀察結(jié)果

淋巴細(xì)胞經(jīng)過AO／EB染色，在熒光顯微鏡下觀察，正常的淋巴細(xì)胞會(huì)被AO染成綠色，而且熒光染料在細(xì)胞內(nèi)分布均勻；如果經(jīng)過染色的細(xì)胞出現(xiàn)橙色且?guī)в芯G色，說明淋巴細(xì)胞處在凋亡初期；如果細(xì)胞出現(xiàn)橙紅色且有凋亡小體的生成，則說明細(xì)胞處在凋亡末期。如果細(xì)胞壞死，則會(huì)被EB染料染成紅色。從圖2中可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的淋巴細(xì)胞大多處在細(xì)胞凋亡末期并且大量細(xì)胞壞死，而試驗(yàn)Ⅰ組中出現(xiàn)的綠色且?guī)в谐壬募?xì)胞，說明細(xì)胞處在凋亡初期；試驗(yàn)Ⅱ組中出現(xiàn)較多的橙色細(xì)胞，試驗(yàn)Ⅲ組出現(xiàn)部分橙紅色和紅色細(xì)胞，說明細(xì)胞從凋亡逐漸轉(zhuǎn)化成壞死。隨著MT添加濃度的增加，破裂淋巴細(xì)胞出現(xiàn)增加趨勢(shì)，橙色的數(shù)量也在增加，而且出現(xiàn)橙紅色和紅色。說明熱應(yīng)激下，添加低濃度MT能夠改善淋巴細(xì)胞的抗熱應(yīng)激作用，較高濃度 MT對(duì)奶牛淋巴細(xì)胞的凋亡無抑制作用或抑制作用很小。

2.3 淋巴細(xì)胞內(nèi)抗氧化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果

從表3中可以看出，試驗(yàn)Ⅰ組和Ⅱ組的奶牛淋巴細(xì)胞內(nèi)的CAT活性顯著高于對(duì)照組和第Ⅲ組（P＜0.01），但試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組之間差異不顯著。細(xì)胞內(nèi)的SOD和GSH-Px的活性，均為試驗(yàn)Ⅰ組顯著高于其他3組（P＜0.01），對(duì)照組的活性最低，且試驗(yàn)Ⅰ～Ⅲ組活性呈逐漸下降的趨勢(shì)。奶牛淋巴細(xì)胞內(nèi)的丙二醛（MDA）含量，對(duì)照組顯著高于其他3組（P＜0.01），試驗(yàn)Ⅰ～Ⅲ組之間差異不顯著（P＞0.05），但有隨著MT含量的提高M(jìn)DA含量依次增高的趨勢(shì)。綜合上述結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)，MT能夠通過提高CAT活性、SOD的活性、GSH-Px的活性和降低MDA含量來改善奶牛淋巴細(xì)胞的抗氧化性能，進(jìn)而提高奶牛淋巴細(xì)胞的抗熱應(yīng)激能力，且MT提高奶牛淋巴細(xì)胞抗氧化能力與其濃度存在密切的聯(lián)系，添加低濃度的效果優(yōu)于高濃度。

表3 淋巴細(xì)胞內(nèi)抗氧化指標(biāo)的檢測(cè)Table 3 Results of the antioxidant indexs of dairy cow lymphocyte

2.4 基因Bax、Bcl-2、p50的RT－PCR檢測(cè)

從表4可以看到，試驗(yàn)Ⅰ～Ⅲ組的Bax基因相對(duì)表達(dá)量分別是對(duì)照組的0.16，0.34和0.24倍，且均顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），其中試驗(yàn)Ⅱ組最高，而試驗(yàn)Ⅰ組最低。說明MT降低了Bax基因相對(duì)表達(dá)量。對(duì)于Bcl-2基因，試驗(yàn)Ⅰ～Ⅲ組表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），分別為對(duì)照組的2.57，1.78和2.13倍，試驗(yàn)Ⅰ組顯著高于試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組（P＜0.01），試驗(yàn)Ⅲ組顯著高于試驗(yàn)Ⅱ組（P＜0.01）。說明MT能提高Bcl-2基因的表達(dá)量，且低濃度的MT效果最好，添加MT濃度的增加，其表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。p50基因的表達(dá)量為試驗(yàn)Ⅰ～Ⅲ組分別是對(duì)照組的0.74，0.65和0.47倍，且各組均顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），其中，試驗(yàn)Ⅰ和Ⅱ組顯著高于試驗(yàn)Ⅲ組（P＜0.01），試驗(yàn)Ⅰ和Ⅱ組之間無顯著差異（P＞0.01），說明添加MT組的淋巴細(xì)胞的p 50基因表達(dá)量下降。

3 討論與結(jié)論

3.1 MT對(duì)熱應(yīng)激下淋巴細(xì)胞形態(tài)的影響

熱應(yīng)激是機(jī)體在高溫環(huán)境下對(duì)熱環(huán)境所做出的非特異性生理反應(yīng)的總和。熱應(yīng)激能夠引起乳鼠的心肌細(xì)胞、奶牛的外周淋巴細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞的凋亡［9-11］。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，在電鏡下觀察，可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)的密度增加，核質(zhì)濃縮、核膜核仁破碎，核膜形成小泡，但是細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)保持完整。細(xì)胞壞死是細(xì)胞受到外界因子的刺激引起細(xì)胞無序變化的死亡，表現(xiàn)為細(xì)胞腫大、胞膜破裂和細(xì)胞內(nèi)容物外溢等。劉慶華等［12］研究熱脅迫下淋巴細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞體積縮小，染色體凝集成團(tuán)，而細(xì)胞膜未改變。在本試驗(yàn)中，熱應(yīng)激導(dǎo)致淋巴細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)的明亮度下降，界限模糊并增強(qiáng)顆粒感，出現(xiàn)很多細(xì)胞的碎片；淋巴細(xì)胞還出現(xiàn)細(xì)胞膜不完整、細(xì)胞腫脹并溶解的現(xiàn)象，與其研究相一致。王艷鳳［13］研究氟對(duì)體外培養(yǎng)牛脾臟淋巴細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常的細(xì)胞被AO染成綠色，細(xì)胞凋亡初期呈橙色，凋亡末期呈橙紅色，而壞死細(xì)胞則被EB染成紅色。從本試驗(yàn)結(jié)果來看，說明熱應(yīng)激能夠?qū)е麦w外培養(yǎng)奶牛淋巴細(xì)胞的凋亡和壞死。MT是一種分子量低、含有高巰基的蛋白質(zhì)，具有抗應(yīng)激的功能。劉穎等［14］研究結(jié)果表明，附子多糖能夠保護(hù)心肌細(xì)胞免受損傷的主要原因是其促進(jìn)MT的合成對(duì)抗氧化應(yīng)激，進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡。在本試驗(yàn)結(jié)果中也可以看出，外源MT能夠延緩熱應(yīng)激下奶牛淋巴細(xì)胞的凋亡，但低濃度的MT效果優(yōu)于高濃度。研究表明，體外細(xì)胞受到應(yīng)激時(shí)，自身能夠產(chǎn)生MT來提高體外細(xì)胞的存活率［15］。那么，淋巴細(xì)胞在熱應(yīng)激情況下，細(xì)胞自身應(yīng)該也會(huì)產(chǎn)生一定量的MT來保護(hù)淋巴細(xì)胞。體外再增加低劑量的MT會(huì)協(xié)同細(xì)胞自身的MT來保護(hù)細(xì)胞免受熱應(yīng)激的損傷。試驗(yàn)中所用的是Zn-MT，據(jù)報(bào)道，氧化型物質(zhì)多，會(huì)使MT的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致Zn2＋容易從MT中脫離［16］。Zn-MT濃度越高，從其脫離的Zn2＋越多，而金屬Zn2＋對(duì)細(xì)胞有一定的毒性。因此，高濃度的Zn-MT會(huì)使淋巴細(xì)胞凋亡和壞死增加。

3.2 MT對(duì)熱應(yīng)激下淋巴細(xì)胞內(nèi)抗氧化功能的影響

機(jī)體在新陳代謝過程中會(huì)產(chǎn)生自由基，自由基具有強(qiáng)氧化性，對(duì)機(jī)體的組織和細(xì)胞具有損傷作用。正常情況下，機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除保持平衡，對(duì)機(jī)體不會(huì)造成傷害，且一定量的自由基對(duì)機(jī)體有好處。但是，過多的自由基大量積累會(huì)因強(qiáng)烈的氧化作用使細(xì)胞中的不飽和脂肪酸產(chǎn)生MDA，而MDA能夠?qū)е录?xì)胞解體，最終促使細(xì)胞死亡［17］。機(jī)體在受到熱應(yīng)激情況下，會(huì)導(dǎo)致活性氧自由基的產(chǎn)生增多，活性氧自由基易與細(xì)胞內(nèi)的大分子進(jìn)行結(jié)合并發(fā)生反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞或組織的脂質(zhì)過氧化作用［18］。MT中含有30%的半胱氨酸，且所有的半胱氨酸殘基均以還原態(tài)出現(xiàn)，容易發(fā)生親和反應(yīng)。與GSH-Px等相比，自由基更容易攻擊MT。因此，MT是一種高效抗氧化劑。MT可提高動(dòng)物機(jī)體的抗氧化物酶活性，從而提高機(jī)體的抗氧化能力。李麗立等［19］給仔豬補(bǔ)充外源性Zn-MT，仔豬肝臟SOD、GSH-Px活性得到顯著提高。張彬等［7］和李麗立等［8］研究注射外源Zn-MT對(duì)奶牛血清的抗氧化性能的影響，結(jié)果MT提高了奶牛的SOD、GSH-Px、CAT和T-AOC的活性，且較高劑量的MT改善抗氧化能力的效果優(yōu)于低劑量，效果表現(xiàn)出一定的時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng)。本試驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在熱應(yīng)激情況下，外源MT能夠提高奶牛淋巴細(xì)胞的SOD、GSH-Px、CAT活性，降低細(xì)胞內(nèi)的MDA含量，從而改善奶牛淋巴細(xì)胞的抗氧化性能，提高奶牛淋巴細(xì)胞的抗熱應(yīng)激能力，且MT提高奶牛淋巴細(xì)胞抗氧化能力與其濃度存在密切的聯(lián)系，添加低濃度的效果優(yōu)于高濃度。Zn是構(gòu)成CuZn-SOD的組成成分，而CuZn-SOD具有清除氧自由基的作用。另外，Zn是GSH-Px的激活劑，當(dāng)Zn缺乏時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的GSH-Px數(shù)量會(huì)減少，GSH-Px發(fā)揮抗氧化作用減弱。在熱應(yīng)激情況下，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的自由基會(huì)使Zn-MT置換出Zn，從而提高SOD、GSH-Px的活性，增強(qiáng)自由基的清除能力，減少M(fèi)DA的產(chǎn)生。然而，有報(bào)道稱，當(dāng)內(nèi)環(huán)境處于高Zn狀態(tài)時(shí)，能夠抑制SOD活性，從而使機(jī)體清除氧自由基的功能降低，過氧化脂質(zhì)堆積。另外，細(xì)胞內(nèi)Zn含量超過生理水平時(shí)，就會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自由基并呈現(xiàn)毒副作用［20］。因此，隨著添加Zn-MT的濃度增加，Zn2＋的含量增加，使奶牛淋巴細(xì)胞內(nèi)處于高Zn狀態(tài)，導(dǎo)致抗氧化酶類的活性有所下降，進(jìn)而促使Zn-MT抗氧化功能下降。

3.3 MT對(duì)熱應(yīng)激下淋巴細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2基因表達(dá)的影響

動(dòng)物機(jī)體在熱應(yīng)激下，機(jī)體發(fā)生紊亂，其自由基增加以及脂質(zhì)過氧化，增加活性氧的積累，而活性氧對(duì)Bax基因的表達(dá)具有促進(jìn)作用。Bax是促凋亡蛋白，Bcl-2是抑制凋亡蛋白，它們之間通過形成異二聚體來維持細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)平衡。另外，Bcl-2還通過阻止細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，抑制線粒體細(xì)胞色素C的釋放，抑制下游的Caspase活化，進(jìn)而阻止細(xì)胞凋亡［21］。如果自由基清除不及時(shí)，導(dǎo)致Bcl-2表達(dá)和Bax表達(dá)不平衡，會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。謝遠(yuǎn)杰等［22］發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激后第3天大鼠生精細(xì)胞的Bcl-2 m RNA表達(dá)明顯下降，而第7天Bax m RNA表達(dá)明顯增加，表明熱應(yīng)激早期導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡主要是因?yàn)锽cl-2表達(dá)減少造成的，后期則由于Bax表達(dá)的不斷增強(qiáng)，進(jìn)一步促進(jìn)生精細(xì)胞的凋亡。汪君民和趙階祥［23］利用免疫組化方法檢測(cè)熱應(yīng)激組的大鼠外周血淋巴細(xì)胞的Bcl-2和Bax基因表達(dá)情況，結(jié)果與其一致。賈丹等［24］試驗(yàn)結(jié)果為熱應(yīng)激下，豬小腸細(xì)胞的Bax基因表達(dá)升高，Bcl-2基因表達(dá)下降，導(dǎo)致小腸絨毛上皮細(xì)胞的凋亡增加。蔡亞非等［10］研究熱應(yīng)激對(duì)奶牛外周血淋巴細(xì)胞Bax-a基因的表達(dá)，結(jié)果熱應(yīng)激下Bax-a基因的表達(dá)量最高，且與淋巴細(xì)胞凋亡率呈平行關(guān)系。另外，宋學(xué)立等［25］通過研究Bcl-2基因轉(zhuǎn)染對(duì)熱應(yīng)激心肌細(xì)胞保護(hù)的作用所得結(jié)果認(rèn)為，在熱應(yīng)激下，Bcl-2基因通過保護(hù)心肌細(xì)胞線粒體H＋-ATPase合成活力，阻抑Caspase 3活化來抑制心肌細(xì)胞的凋亡。MT含有大量的巰基基團(tuán)，還原狀態(tài)的巰基具有親核性，自由基容易與其結(jié)合，降低體內(nèi)的氧自由基，進(jìn)而降低Bax基因的表達(dá)。孫忠東等［26］研究發(fā)現(xiàn)，用ZnSO4誘導(dǎo)產(chǎn)生的MT能夠促使大鼠心肌Bcl-2蛋白的表達(dá)增加，Bax蛋白表達(dá)下降。羅佳捷等［27］研究Zn-MT對(duì)熱應(yīng)激下奶牛淋巴細(xì)胞的凋亡基因的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bax基因表達(dá)量較對(duì)照組降低，Bcl-2基因表達(dá)增強(qiáng)。另外，Alessandrra等［28］通過試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)MT對(duì)Bcl-2蛋白表達(dá)有促進(jìn)作用，認(rèn)為MT在調(diào)控多形性腺瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。從本試驗(yàn)看，試驗(yàn)組的Bax基因表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），Bcl-2基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），Bax／Bcl-2下降，抑制了淋巴細(xì)胞的凋亡。說明在一定程度上添加適量外源MT抑制了淋巴細(xì)胞的凋亡。Caspase蛋白的級(jí)聯(lián)活動(dòng)是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，由Bcl-2蛋白家族和凋亡抑制蛋白家族（IAPs）聯(lián)合調(diào)控。Zn2＋能夠與IAPs形成鋅指結(jié)構(gòu)，激發(fā)其活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。另外，核酸內(nèi)切酶中含有相同的Zn2＋、Ca2＋競(jìng)爭(zhēng)位點(diǎn)，當(dāng)Zn2＋濃度達(dá)到一定程度Zn2＋能夠和Ca2＋競(jìng)爭(zhēng)與核酸內(nèi)切酶結(jié)合，抑制核酸酶的活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞的凋亡。但是，當(dāng)Zn2＋濃度過高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的DNA降解，促使細(xì)胞凋亡進(jìn)而死亡［29-30］。因此，在本試驗(yàn)中，添加低濃度的Zn-MT，游離出的Zn2＋也發(fā)揮了抑制細(xì)胞凋亡的作用，但是隨著添加劑量的增加，Zn2＋對(duì)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生了一定的毒性，進(jìn)而導(dǎo)致抑制細(xì)胞凋亡的作用呈下降趨勢(shì)。在熱應(yīng)激下，機(jī)體很容易合成各種熱休克蛋白。研究表明，熱休克蛋白家族的Hsp70和Hsp40在協(xié)同作用下抑制Bax的活化，阻斷其促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Hsp60能與Bax形成復(fù)合物以及增強(qiáng)Bcl-2的作用，進(jìn)而抑制細(xì)胞的凋亡；Bcl-2／Hsp 90β復(fù)合物能夠抑制細(xì)胞色素C和Caspase3的釋放［31-33］。羅佳捷等［27］發(fā)現(xiàn)MT對(duì)熱應(yīng)激下，奶牛血液淋巴細(xì)胞的Hsp 70基因的表達(dá)具有提高作用。因此，認(rèn)為在熱應(yīng)激下，MT能通過調(diào)控?zé)嵝菘说鞍缀图?xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡。但是，MT是否是同時(shí)調(diào)控?zé)嵝菘说鞍缀图?xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)還是調(diào)控?zé)嵝菘说鞍缀图?xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)之間存在先后順序，需要進(jìn)一步深入的研究。

3.4 MT對(duì)熱應(yīng)激下淋巴細(xì)胞內(nèi)p50基因表達(dá)的影響

在哺乳動(dòng)物中，NF-κB主要由5個(gè)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（p65、p 50、p 52、Rel B和c-Rel）之間形成同源或異源二聚體組成的，研究最多的是p50／p65二聚體。據(jù)報(bào)道，活化的NF-κB對(duì)多種與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，對(duì)細(xì)胞凋亡具有抑制和促進(jìn)的作用［34］。NF-κB抑制細(xì)胞凋亡是一種多個(gè)信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)激活I(lǐng)EX-IL、Bcl-2家族等提高機(jī)體的抗細(xì)胞凋亡的作用［35］。夏鈺弘等［36］研究結(jié)果表明，NF-κB可能通過抑制Caspase-3的活性進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞凋亡。然而，也有報(bào)道稱，NF-κB對(duì)細(xì)胞的凋亡有促進(jìn)的作用。研究發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤細(xì)胞在紫外線誘導(dǎo)下會(huì)因NF-κB的活化而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；在H2O2的誘導(dǎo)下，活化的NF-κB能使T細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡［37-38］。另外還發(fā)現(xiàn)，活化的NF-κB能夠通過抑制抗凋亡基因的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡［39］。之前研究結(jié)果表明，添加Zn-MT能夠提高淋巴細(xì)胞Bcl-2基因的表達(dá)量，降低Bax基因的表達(dá)量，抑制細(xì)胞的凋亡。而研究Zn-MT對(duì)淋巴細(xì)胞p 50基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)在熱應(yīng)激下，與對(duì)照組相比，添加Zn-MT組的奶牛淋巴細(xì)胞內(nèi)的p50基因表達(dá)量下降。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能原因如下：在正常情況下，NF-κB由于與其抑制蛋白（IκB）相結(jié)合而無活性。當(dāng)淋巴細(xì)胞受到熱應(yīng)激時(shí)，促使IκB磷酸化，導(dǎo)致NF-κB激活。研究已發(fā)現(xiàn)，NF-κB對(duì)細(xì)胞凋亡有雙向作用，激活的NF-κB具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，因此，本試驗(yàn)的結(jié)果說明，MT可能通過抑制p50基因的表達(dá)，抑制IκB磷酸化，降低NF-κB的活性，從而降低NF-κB抑制抗凋亡基因的表達(dá)，抑制淋巴細(xì)胞的凋亡。

在熱應(yīng)激下，添加外源MT能夠提高奶牛淋巴細(xì)胞的存活率，降低淋巴細(xì)胞的凋亡率；提高淋巴細(xì)胞內(nèi)的CAT活性、SOD活性和GSH-Px活性，降低MDA含量，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的抗氧化性能；提高淋巴細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2基因的表達(dá)量，降低Bax基因和p 50基因的表達(dá)量，從而抑制淋巴細(xì)胞的凋亡。從本試驗(yàn)的結(jié)果上看，添加終濃度為70μg／m L的MT抑制熱應(yīng)激下體外培養(yǎng)奶牛淋巴細(xì)胞凋亡的效果最好。