氯沙坦對(duì)百草枯急性染毒大鼠肺組織氧化損傷的影響

郭 芳，孫應(yīng)彪，李 盛，蘇 莉，劉志飛，趙 遲

(1.蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，甘肅蘭州 730000;2.蘭州市疾病預(yù)防控制中心，甘肅蘭州 730030)

百草枯(paraquat，PQ)屬有機(jī)雜環(huán)類接觸性脫葉劑及除草劑，對(duì)人畜均有較強(qiáng)毒性，因缺乏特效解毒劑及有效降低毒物毒性的治療手段，PQ急性中毒是臨床常見(jiàn)除草劑急性中毒之一，病死率高達(dá)50% ～80%［1］。氧化應(yīng)激是目前公認(rèn)的 PQ中毒機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，NF－κB作為一個(gè)氧化應(yīng)激敏感型轉(zhuǎn)錄因子可被PQ中毒后產(chǎn)生的大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)激活，使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，活化后的NF－κB還可進(jìn)一步引起炎癥反應(yīng)和肺組織纖維化的發(fā)生［2］。

腎素－血管緊張素(angiotensin，Ang)系統(tǒng)廣泛存在于腎、心、肺和肝等組織，能夠獨(dú)自合成AngⅡ，AngⅡ是機(jī)體組織纖維化調(diào)節(jié)器，能夠通過(guò)AngⅡ1型受體(AngⅡ type 1 receptor，AT1R)的激活誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞的擴(kuò)散和肺間質(zhì)膠原蛋白沉積［3－4］。在正常大鼠肺組織中，存在大量 AT1R［5］，AngⅡ與AT1R結(jié)合可引起肺成纖維細(xì)胞的擴(kuò)散進(jìn)而引起肺部嚴(yán)重?fù)p傷和肺纖維化。氯沙坦作為AT1R拮抗劑，可保護(hù)由高氧引起的小鼠肺損傷并抑制肺部纖維化的發(fā)生［6］。本研究通過(guò)建立PQ急性肺損傷大鼠模型，觀察氯沙坦對(duì)PQ所致肺組織形態(tài)、氧化應(yīng)激和NF－κB基因表達(dá)水平異常變化的干預(yù)作用，為臨床PQ急性中毒治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇SPF級(jí)成年雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量180～220 g，甘肅省中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào) SCXK［甘］2011－0001－0001011。

1.2 試劑和儀器

PQ，美國(guó)Sigma公司;氯沙坦鉀片，杭州默沙東制藥有限公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)、脂質(zhì)過(guò)氧化物(lipid peroxide，LPO)和總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T－AOC)測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所;Trizol試劑，美國(guó)Life Technology公司;NF－κB和β肌動(dòng)蛋白引物(表1)，上海捷瑞生物工程有限公司;逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司。Eon全功能多波段酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司;722型分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;BX53光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司;SmartSpec Plus核酸蛋白測(cè)定儀和 CFX96 Real－Time System，美國(guó) Bio－Rad 公司;Microfuge22R型低溫離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司;TC－512型普通PCR儀，北京瑞爾欣德科技有限公司。

Tab.1 Primer sequences and theoretical amplification lengths

1.3 動(dòng)物分組和處理

選擇32只健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、PQ染毒組以及氯沙坦干預(yù)7 d(PQ+氯沙坦7 d)和14 d(PQ+氯沙坦14 d)組。正常對(duì)照組大鼠每天ig給予生理鹽水10 mL·kg－1，連續(xù)15 d。PQ染毒組一次性 ig PQ 40 mg·kg－1染毒，此后每天等容積ig給予生理鹽水至第15天。氯沙坦干預(yù)7和14 d組于一次性ig給予PQ 40 mg·kg－1染毒后次日，根據(jù)臨床成人每天用藥等效劑量ig給予氯沙坦10 mg·kg－1，每天1次，連續(xù)7和14 d。

1.4 肺組織病理變化觀察

各組大鼠于給藥第16天采用頸椎脫位法處死，取右肺中葉用4%多聚甲醛固定，常規(guī)制備石蠟切片并行HE染色，觀察肺組織病理學(xué)改變，以確定急性肺損傷造模是否成功。光學(xué)顯微鏡觀察肺組織病理組織學(xué)變化。剩余肺組織用無(wú)菌生理鹽水漂洗后液氮中凍存，用于其他指標(biāo)檢測(cè)。

1.5 肺組織勻漿中 T－SOD，CAT，LPO和 T－AOC水平測(cè)定

準(zhǔn)確稱取左側(cè)肺組織，按質(zhì)量(g):體積(mL)=1∶9的比例加入無(wú)菌生理鹽水，冰水浴勻漿，1000×g離心10 min，取上清液BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，并根據(jù)試劑盒操作步驟檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果用單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中各指標(biāo)含量表示。

1.6 大鼠肺組織NF－κB mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

取液氮中保存的肺組織約100 mg加入1 mL Trizol于冰浴中勻漿并提取總RNA，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度并確保其A260nm/A280nm在1.8～2.2之間。根據(jù) RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，選擇10 μL反應(yīng)體系，于 37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃5 min將 RNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，－20℃保存。以cDNA為模板，用 NF－κB引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，內(nèi)參照為β肌動(dòng)蛋白。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)過(guò)程嚴(yán)格按照SYBR Premix Ex TapⅡ試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。所有樣品均采用相同的閾值得到Ct值并采用Pfaffl法［7］計(jì)算NF－κB mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 氯沙坦干預(yù)后大鼠肺組織病理改變

如圖1所示，正常對(duì)照組肺泡間隔及肺泡腔大小如常，肺泡間隔內(nèi)未見(jiàn)明顯膠原沉積及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)小血管管壁如常(圖1A)。PQ染毒組肺泡間隔彌漫性顯著增寬，肺泡腔狹窄或閉合，肺泡間隔及肺間質(zhì)內(nèi)大量膠原沉積，成纖維細(xì)胞增生，部分區(qū)域可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)小血管壁增厚，管腔狹窄(圖1B)。氯沙坦7 d干預(yù)組肺損傷比PQ組減輕，肺間質(zhì)膠原沉積減少，但多數(shù)區(qū)域肺間質(zhì)內(nèi)仍有成纖維細(xì)胞增生，間質(zhì)小血管管壁仍增厚(圖1C)。氯沙坦14 d干預(yù)組肺組織多數(shù)區(qū)域接近正常，肺間質(zhì)膠原沉積進(jìn)一步減少，間質(zhì)小血管管壁輕微增厚(圖1D)。

Fig.1 Effect of losartan on paraquat(PQ)induced histopathological changes of lung tissuein rats(HE ×200).The rats were ig given losartan 10 mg·kg －1for 7 and 14 d after being single ig given PQ 40 mg·kg －1.A:normal control group;B:PQ group;C － D:losartan intervention for 7 and 14 d groups，respectively.The arrows show lung interstitial capillary.

Tab.2 Effect of losartan on oxidative stress change in lung tissues of rats induced by PQ

2.2 氯沙坦干預(yù)后大鼠肺組織氧化應(yīng)激水平的變化

由表2可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，PQ染毒后大鼠肺組織中T－SOD和CAT活性明顯降低，T－AOC明顯減弱，LPO 含量明顯升高(P ＜0.05，P ＜0.01)。與PQ染毒組比較，氯沙坦干預(yù)7 d大鼠肺組織中T－SOD和CAT活性明顯回升(P＜0.05，P＜0.01)，T－AOC活性和LPO含量無(wú)明顯變化;氯沙坦干預(yù)14 d T－SOD和CAT活性及T－AOC均明顯升高，LPO 含量明顯降低(P ＜0.05，P ＜0.01)，均恢復(fù)接近正常水平。提示氯沙坦對(duì)PQ急性染毒大鼠肺組織中 T－SOD，CAT，T－AOC 和 LPO 活性或含量的異常變化具有逆轉(zhuǎn)作用。

2.3 氯沙坦干預(yù)后大鼠肺組織NF－κB mRNA表達(dá)水平的變化

由圖2可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，PQ組大鼠肺組織中 NF－κB mRNA表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)。與PQ染毒組比較，氯沙坦干預(yù)7和14 d大鼠肺組織中 NF－κB mRNA含量明顯下降(P＜0.05)，基本恢復(fù)接近正常水平。

Fig.2 Effect of losartan on NF－κB mRNA expression induced by PQ in lung tissue of rats by real－time quantitative PCR.See Fig.1 for the rat treatment.The NK－κB mRNA expression was analyzed by Pfaffl method.±s，n=8.*P ＜0.05，compared with normal control group;#P ＜0.05，compared with PQ group.

3 討論

據(jù)報(bào)道，肺泡上皮細(xì)胞和氣管Clara細(xì)胞借助多胺攝取途徑將PQ轉(zhuǎn)運(yùn)入肺并產(chǎn)生大量ROS，導(dǎo)致機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)而引發(fā)鏈?zhǔn)街|(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，使細(xì)胞膜受體、膜蛋白酶和離子通道脂質(zhì)的微環(huán)境發(fā)生改變，引起肺組織氧化性損傷［8］。正常情況下機(jī)體內(nèi)存在著消除自由基的防御體系，其中SOD和CAT活性直接反映機(jī)體清除ROS的能力［9］。據(jù)報(bào)道，PQ進(jìn)入人體內(nèi)后經(jīng)由NADPH輔助的單電子還原為自由基，該自由基能與氧反應(yīng)形成超氧陰離子，后者能誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的ROS如過(guò)氧化氫、羥自由基等，間接使體內(nèi)SOD活力降低，并誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的LPO，最終引起肺泡間質(zhì)不可逆的纖維化［10－11］。本研究結(jié)果表明，PQ染毒組肺組織中SOD和CAT活性明顯降低，T－AOC明顯減弱，而LPO含量明顯升高，提示PQ中毒早期氧化應(yīng)激損害占有重要地位。

NF－κB屬于對(duì)氧化還原敏感的Rel蛋白家族。因此，ROS的釋放和氧化還原狀態(tài)的改變可直接激活 NF－κB［12］。被活化的 NF－κB 引起細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控失衡，大量炎性因子的產(chǎn)生導(dǎo)致肺部炎癥的發(fā)生并最終引起肺纖維化［2］。本研究結(jié)果表明，PQ染毒后大鼠肺組織病理改變主要表現(xiàn)為肺泡間隔顯著增寬，肺泡腔狹窄或閉合，部分區(qū)域可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原蛋白沉積;同時(shí)肺組織NF－κB mRNA明顯上調(diào)。提示NF－κB參與了PQ急性肺損傷過(guò)程。

氯沙坦是常見(jiàn)的AT1R拮抗劑，可選擇性地作用于AT1R，以阻斷內(nèi)源性和外源性的AngⅡ所產(chǎn)生的各種生理反應(yīng)。在脂多糖誘導(dǎo)的大鼠肺損傷模型中，氯沙坦干預(yù)可顯著抑制AT1R和NF－κB活性［13］。此外，氯沙坦可通過(guò)抗自由基和阻斷AngⅡ的促炎反應(yīng)治療平陽(yáng)霉素引起的大鼠肺損傷［14］。本研究結(jié)果表明，隨著氯沙坦干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，PQ染毒組大鼠肺組織中SOD和CAT活性及T－AOC明顯增強(qiáng)，LPO含量明顯降低，NF－κB mRNA表達(dá)明顯降低。肺組織病理觀察結(jié)果表明，氯沙坦干預(yù)14 d肺組織大多數(shù)區(qū)域未見(jiàn)明顯病變，并接近于正常水平。

綜上所述，氯沙坦通過(guò)增強(qiáng)肺組織的抗氧化能力和降低NF－κB mRNA表達(dá)而減輕PQ所致的急性肺損傷，為臨床綜合治療PQ急性中毒提供新的思路。

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