印染廢水中活的但非可培養(yǎng)狀態(tài)細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)

金夷　胡佳丹　張麗　楊娜　馬英川　梅榮武　韋彥斐　陳建榮　王慧榮　王方園　李明智　吳冬梅　徐鴻　徐龍乾　沈佳琪　吳霞

摘 要：【目的】探明印染廢水生物反應(yīng)器中活的非可培養(yǎng)（viable but non-culturable，VBNC）細(xì)菌及其系統(tǒng)關(guān)系?！痉椒ā坷猛临|(zhì)濾材構(gòu)建生物反應(yīng)器，基于復(fù)蘇促進(jìn)因子（resuscitation promoting factor，Rpf） 對VBNC細(xì)菌的復(fù)蘇刺激生長作用，采用最大可能數(shù)法（most probable number，MPN）及其MPN培養(yǎng)系判斷樣品中的細(xì)菌總數(shù)，稀釋平板法分離其中復(fù)蘇可培養(yǎng)化的VBNC菌株，解析16S rRNA基因系統(tǒng)關(guān)系?！窘Y(jié)果】（1）MPN培養(yǎng)系中，處理組MPN值對應(yīng)的細(xì)菌總數(shù)為9.3×106～2.4×108，大于對照組MPN值對應(yīng)的細(xì)菌總數(shù)4.3×106～9.3×106，表明添加Rpf后可培養(yǎng)化細(xì)菌總數(shù)最高從每g樣品的7.5×106提高到2.4×108；（2）添加Rpf可使樣品中細(xì)菌分離豐度提高2.2～32倍，表明印染廢水生物反應(yīng)器中存在對Rpf敏感、復(fù)蘇可培養(yǎng)化的VBNC優(yōu)勢菌群；（3）MPN培養(yǎng)系中處理組稀釋段培養(yǎng)液的OD660值大于對照組的OD660值，表明Rpf對部分細(xì)菌菌種有生長刺激作用。【結(jié)論】利用復(fù)蘇促進(jìn)因子Rpf，探明了印染廢水生物反應(yīng)器中存在對Rpf敏感的VBNC菌種，包括放線菌、革蘭氏陽性以及革蘭氏陰性菌。本研究結(jié)果揭示了印染廢水中存在大量活的但非可培養(yǎng)狀態(tài)細(xì)菌，這將為其形成機(jī)理、復(fù)蘇活性化機(jī)制以及印染廢水深度處理工程工藝改進(jìn)等方面的深入研究提供重要的思路與方法。

關(guān)鍵詞：印染廢水 生物反應(yīng)器 VBNC菌 Rpf 16S rRNA基因序列系統(tǒng)關(guān)系

中圖分類號：X703 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-098X（2014）07（b）-0103-02

全球每年都會排放大量的印染廢水，因其成分復(fù)雜，堿度、有機(jī)物含量、色度以及化學(xué)需氧量高，生化降解性相對較低，排放量大、水質(zhì)變動范圍廣，屬難處理的工業(yè)廢水。大量難降解染料的過量使用及排放已造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，某些毒性物質(zhì)對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，印染廢水的深度處理已經(jīng)引起社會廣泛關(guān)注，而其中高效微生物處理技術(shù)的開發(fā)已經(jīng)成為行業(yè)令人矚目的研究熱點(diǎn)。

利用傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術(shù)從土壤、活性污泥、海水、湖水、沉淀物以及城市污水處理系統(tǒng)等環(huán)境中能分離培養(yǎng)的微生物只占總數(shù)的0.01%～10%，其他的為未培養(yǎng)（uncultivated microorganisms） 或?yàn)榛畹牡强膳囵B(yǎng)（viable but nonculturable， VBNC），表明多種生態(tài)環(huán)境中絕大部分微生物尚處于未知狀態(tài)。

自從1982年Xu等人首次在環(huán)境中發(fā)現(xiàn)生存但不可培養(yǎng)的霍亂弧菌和大腸桿菌后，至今國內(nèi)外已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了VBNC菌的相關(guān)內(nèi)容。細(xì)菌由于多種因素導(dǎo)致進(jìn)入VBNC狀態(tài)，該類微生物在不良環(huán)境條件下具有生物活性，用常規(guī)培養(yǎng)法無法檢出，但在一定條件下可以復(fù)蘇并保存原有功能的一種特殊生理狀態(tài)。盡管VBNC菌處于低代謝狀態(tài)，但1998年Mukamolova等報(bào)道了藤黃微球菌 Micrococcus luteus在對數(shù)期后期分泌的一種蛋白質(zhì)能使該菌以及近緣的分枝桿菌Mycobacterium屬的一些處于VBNC狀態(tài)的細(xì)胞復(fù)蘇成為可培養(yǎng)化，這種蛋白質(zhì)被命名為復(fù)蘇促進(jìn)因子Rpf（resuscitation promoting factor）。已有研究表明Rpf能復(fù)蘇刺激大量革蘭氏陽性菌的生長，包括Mycobacterium， Rhodococcus，Arthrobacter， Leifsonia，Bacillus， Nocardia， Kitasatospora，Streptomyces 和Paenibacillus屬的細(xì)菌。丁等研究表明Rpf對難培養(yǎng)微好氧貧營養(yǎng)革蘭氏陰性菌Curvibacter fontanus具有良好的促進(jìn)生長的功能。

該文介紹利用復(fù)蘇促進(jìn)因子Rpf蛋白信號分子對VBNC細(xì)菌的復(fù)蘇刺激生長作用，在設(shè)計(jì)的MPN培養(yǎng)系中，通過計(jì)數(shù)MPN值換算獲得樣品細(xì)菌總數(shù)，驗(yàn)證Rpf對VBNC菌種的復(fù)蘇促進(jìn)作用，從印染廢水處理系統(tǒng)中分離處于VBNC狀態(tài)菌群、解析其組成與16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 Rpf的制備

實(shí)驗(yàn)菌種藤黃微球菌Micrococcus luteus IAM 14879（=NCIMB 13267）由東京大學(xué)分子細(xì)胞生物學(xué)研究所國際菌種保藏中心提供。依據(jù)介紹的方法制備M. luteus的DNA，確定rpf基因引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，利用pET15b質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DE3 表達(dá)，以SDS-PAGE 檢驗(yàn)獲取純化重組蛋白。rpf基因陽性菌（MpET15brpf-P）在LB培養(yǎng)基（Tryptone 10 g/L，Yeast extract 5 g/L， NaCl 10 g/L）、37 ℃、120/rpm條件下培養(yǎng)，以IPTG最佳條件誘導(dǎo)獲得高表達(dá)Rpf蛋白，再以SDS-PAGE 檢驗(yàn)確證標(biāo)的蛋白。將培養(yǎng)液離心經(jīng)0.22 μm膜過濾，保存在-20 ℃作為含Rpf的實(shí)驗(yàn)處理組添加材料。同時(shí)以rpf基因陰性菌（MpET15brpf-N）相同方法進(jìn)行培養(yǎng)、離心和過濾的培養(yǎng)液作為不含Rpf的實(shí)驗(yàn)對照組添加材料。

1.1.2 樣品及處理

利用特殊土質(zhì)過濾材料構(gòu)建連續(xù)流生物反應(yīng)器。印染廢水為浙江某印染廢水處理廠經(jīng)處理后的，經(jīng)生物反應(yīng)器（串聯(lián)多塔式）連續(xù)流運(yùn)行61 d、83 d和366 d，分別從生物反應(yīng)器最初出水段三點(diǎn)取樣共取3g土（折算為干重）至滅菌的100 mL錐形瓶中，加入27 mL滅菌蒸餾水?dāng)嚢?0 min均勻做成懸液待用。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.1.3 培養(yǎng)基

MPN培養(yǎng)系中液體培養(yǎng)基組成：蛋白胨5.0 g，酵母膏0.5 g，葡萄糖5.0 vg，NaCl 2.5 g，苯乙醇（分析純）3.0 mL，去離子水1000 mL，pH調(diào)至 7.0。稀釋平板分離用固體培養(yǎng)基為加瓊脂20.0 g /L。實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基均經(jīng)121 ℃、15 min高壓滅菌鍋滅菌后使用。endprint

1.1.4 主要試劑及儀器

SK1201-UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，UNIQ-10 DNA膠回收試劑盒，16S rRNA基因PCR擴(kuò)增所用酶、引物和試劑均購于上海生工公司；PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀（TP600日本Takara公司），凝膠成像系統(tǒng)（121409美國UVP公司），酶標(biāo)儀（1510美國Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 MPN法和MPN培養(yǎng)系

本實(shí)驗(yàn)利用MPN法和MPN培養(yǎng)系計(jì)數(shù)樣品可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)。以2.5～5 mL透明玻璃瓶作為培養(yǎng)容器，添加1%（v/v，用量確定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)未顯示）含Rpf制備液至液體培養(yǎng)基中作為處理組，以添加等量不含Rpf制備液作為對照組，將以10%（v/v） 的樣品懸液（在前項(xiàng)1.1.2所述），以十倍濃度梯度稀釋到10-8，每組重復(fù)3次，30℃靜置培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)時(shí)間測定處理組與對照組吸光值的變化（OD 660nm），并以O(shè)D660值以及肉眼判斷，記錄處理組與對照組培養(yǎng)液的混濁情況，渾濁為陽性，不渾濁為陰性。利用MPN表查出MPN值對應(yīng)的處理組與對照組中的細(xì)菌總數(shù)。

1.2.2 Rpf復(fù)蘇效果與VBNC狀態(tài)菌的判斷

本實(shí)驗(yàn)中以處理組與對照組MPN值分別對應(yīng)的細(xì)菌總數(shù)之比作為Rpf復(fù)蘇效果，基于Rpf效果確定復(fù)蘇可培養(yǎng)化的VBNC以及促進(jìn)生長作用的細(xì)菌。當(dāng)復(fù)蘇效果大于5（95%置信度），處理組的最前方某稀釋段培養(yǎng)液渾濁（陽性），而對照組與之相同稀釋段為不渾濁（陰性）時(shí)，處理組渾濁培養(yǎng)液經(jīng)稀釋平板分離，純化所得的菌為單位樣品中總數(shù)處于優(yōu)勢的VBNC狀態(tài)菌。

1.2.3 菌株分離純化與保存

經(jīng)3～14 d靜置培養(yǎng)并視MPN值趨于穩(wěn)定情況，將處理組與對照組中最先端呈渾濁的培養(yǎng)液稀釋，利用平板分離法篩選、純化獲得相應(yīng)的可培養(yǎng)化的細(xì)菌菌種。將純化的細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)用于細(xì)菌鑒定，以及添加10%的甘油做成冷凍甘油管在-80 ℃保存。

2 結(jié)果

2.1 MPN培養(yǎng)系中MPN值與樣品細(xì)菌總數(shù)

從印染廢水連續(xù)流生物反應(yīng)器中共取樣3次，在MPN培養(yǎng)系中處理組與對照組的MPN值與每g樣品中的細(xì)菌總數(shù)分別是2.4×107、2.4×108 、9.3×106和9.3×106、7.5×106 、4.3×106。表明基于添加Rpf后，從單位樣品中檢出的可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)分別提高了62.0%、97.0%和54.0%，換言之，樣品中至少分別有62.0%、97.0%和54.0%的細(xì)胞原來處于VBNC狀態(tài)，表明利用一般培養(yǎng)基能被分離的細(xì)菌不到半數(shù)，甚至只有3%。證實(shí)印染廢水生物反應(yīng)器中存在一般培養(yǎng)基不能檢出、添加Rpf后能復(fù)蘇生長成為可培養(yǎng)化的VBNC狀態(tài)細(xì)菌。

2.2 Rpf復(fù)蘇效果及其培養(yǎng)液OD660值的變化

實(shí)驗(yàn)中我們定義了處理組可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)除以對照組可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)，表示Rpf復(fù)蘇效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，不同運(yùn)行時(shí)間段取樣分析的Rpf復(fù)蘇效果分別為2.6、32和2.2，表明印染廢水生物反應(yīng)器中，取樣點(diǎn)單位樣品中存在對Rpf敏感的VBNC優(yōu)勢菌群，同時(shí)量化的2.6、32和2.2為Rpf實(shí)際復(fù)蘇效果。

2.3 分離菌株的16S rRNA基因序列同源性與系統(tǒng)樹

分離純化菌種經(jīng)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物有限公司測序，所得菌株16S rRNA基因序列結(jié)果在國際基因庫DDBJ登錄取得菌株登錄號碼。本實(shí)驗(yàn)研究分離的菌株為該基因庫首次向世界公布的利用Rpf在MPN培養(yǎng)系中分離取得的VBNC菌。如YRJ6菌株的近緣菌種Moraxella osloensis，登錄網(wǎng)址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB847896/，/isolation_source =“printing and dyeing wastewater”。資料顯示該菌種為從印染廢水中基于Rpf和MPN培養(yǎng)系分離取得的VBNC菌。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究利用復(fù)蘇促進(jìn)因子Rpf，在MPN培養(yǎng)體系中，添加Rpf后單位樣品中處理組比對照組檢出的細(xì)菌總數(shù)增加了54.0%～97.0%，證實(shí)了印染廢水中存在著大量處于VBNC狀態(tài)的細(xì)菌。Rpf有效復(fù)蘇效果為2.2～32，表明印染廢水生物反應(yīng)器中存在對Rpf敏感的VBNC優(yōu)勢菌群。處理組培養(yǎng)液的OD660值均大于對照組，表明Rpf對處理組中的細(xì)菌具有明顯的生長刺激作用。通過稀釋平板分離后，從處理組中分離到較多的菌株表現(xiàn)出更高的多樣性，其中YDWLR1， YDWLR2， YDWLR6， YDWHR2， YDWLR5， YRJ1和YRJ6菌株，單位樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)達(dá)到106～108數(shù)量級，它們分別是Tepidimonas， Cupriavidus， Gordonia， Staphylococcus， Bucillus， Moraxella， Ochrobactrum和 Enhydrobacter屬的近緣菌種，而在對照組培養(yǎng)液中，細(xì)菌總數(shù)106～108同等數(shù)量級中，則沒有發(fā)現(xiàn)這些菌種。因而這些細(xì)菌可視為經(jīng)Rpf復(fù)蘇生長促進(jìn)作用成為可培養(yǎng)化的VBNC細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bucillus屬的處于VBNC狀態(tài)細(xì)菌在印染廢水中出現(xiàn)概率較高，占分離菌株的48%。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了該屬細(xì)菌中雖不處于VBNC狀態(tài)，但Rpf對其具有明顯的生長促進(jìn)作用的菌種。

參考文獻(xiàn)

[1] Colwell R， Brayton P， Grimes D， et al.Viable but non-culturable Vibrio cholerae and related pathogens in the environment： implications for release of genetically engineered microorganisms[J].Nature biotechnology，1985，3（9）：817-820.

[2] 丁林賢，蘇曉梅，橫田明.活的但非可培養(yǎng)（VBNC）狀態(tài)菌的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)報(bào)，2011，51（7）：858-862

[3] 丁林賢，張萍華，洪華嫦，等.2012.藤黃微球菌Rpf活性蛋白的制取及其對紅球菌VBNC菌體的復(fù)蘇作用[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2012，52（1）：77-82

[4] Ding L（丁林賢），Yokota A. Curvibacter fontana sp. nov.， a microaerobic bacteria isolated from well water[J].The Journal of general and applied microbiology，2010，56（3）：267-271.

[5] Fegan N， Higgs G， Vanderlinde P， et al.Enumeration of Escherichia coli O157 in cattle faeces using most probable number technique and automated immunomagnetic separation[J]. Letters in applied microbiology， 2004，38（1）：56-59.endprint