家蠅抗菌肽defensin對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖、凋亡和周期的影響*

程璟俠 焦莉萍 趙瑞君 原發(fā)家 杜 斌 王文建

(1. 山西省疾病預(yù)防控制中心, 太原 030001; 2. 山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，寄生蟲(chóng)教研室，太原 030001)

抗菌肽是昆蟲(chóng)體內(nèi)重要的先天性免疫分子，研究表明抗菌肽具有良好的抗菌作用，免疫調(diào)節(jié)作用，抗寄生蟲(chóng)、抗腫瘤作用，抗菌肽在殺傷腫瘤細(xì)胞作用的同時(shí)對(duì)正常人體細(xì)胞影響較小(Casteelsetal.,1989)，這是天然抗腫瘤藥物的一個(gè)重要特點(diǎn)(許玉澄等，1998)。防御素(Defensin)是抗菌肽家族中最大的亞家族，從哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、植物中分離出來(lái)并且充當(dāng)自然免疫的效應(yīng)分子，它是機(jī)體有效抵抗病原菌感染的第一步(Lietal., 2012) 起到調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)的作用。丘曉燕等(2003)從舍(家)蠅幼蟲(chóng)中提取的抗菌肽類物質(zhì)能抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人胃癌細(xì)胞BGC-823、MCC-803 和人肺癌細(xì)胞SPC-A-1等人源性腫瘤細(xì)胞的體外增殖生長(zhǎng)。國(guó)內(nèi)報(bào)道的用家蠅幼蟲(chóng)勻漿提取的混合物(萬(wàn)啟惠等，2008；張慶華等，2007；Jinetal., 2010)和血淋巴直接凍干粉獲得的雜合多肽(文彩虹等，2004)對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞、A375、K562等腫瘤細(xì)胞均有抑制作用，并且對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒性。本課題組利用分子生物學(xué)方法從家蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)提取抗菌肽defensin并研究其對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2腫瘤細(xì)胞的作用及對(duì)人正常心肌細(xì)胞H9C2的作用。結(jié)果證明家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽defensin對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯的殺傷作用，并發(fā)現(xiàn)該抗菌肽defensin對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡有一定的影響，為天然抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)的理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞株：人肝癌細(xì)胞HepG2和人正常心肌細(xì)胞H9C2均為山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室惠贈(zèng)。

1.1.2家蠅抗菌肽defensin：防御素defensin從家蠅體內(nèi)提取，并經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)、表達(dá)及純化制備而成，經(jīng)抑菌活性鑒定有殺菌效果。

1.1.3材料和試劑：AnnexinV-Fitc-PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；DMEM干粉，美國(guó)Gibco公司；RPMI 1640培養(yǎng)基，賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司；胎牛血清，杭州四季青公司；四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT)，美國(guó)Sigma公司。

1.1.4實(shí)驗(yàn)設(shè)備與儀器：流式細(xì)胞儀 FACS Calibur，B.D Corp，USA；自動(dòng)板式酶標(biāo)儀ZS-2，北京新風(fēng)機(jī)械廠；倒置生物顯微鏡XDS-IB，重慶光電儀器有限公司。高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)TGL-16G，上海安亭科學(xué)儀器廠。立式壓力蒸氣滅菌器YXQ-LS-30S，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；CO2培養(yǎng)箱，311，美國(guó)Thermo Forma公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng)及光鏡觀察法檢測(cè)defensin抗腫瘤活性：將人肝癌細(xì)胞HepG2培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，放于5%的CO2培養(yǎng)箱中。調(diào)整細(xì)胞濃度在l×105個(gè)/mL,將正常人心肌細(xì)胞H9C2培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,其余培養(yǎng)方式同腫瘤細(xì)胞相同，調(diào)整細(xì)胞濃度在 2.5×105個(gè)/mL左右。設(shè)置對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組中用DMEM培養(yǎng)液與抗菌肽defensin混合配置，并將其加入含肝癌細(xì)胞HepG2的培養(yǎng)瓶中，對(duì)照組加不含血清的DMEM培養(yǎng)液。放置37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中，48 h后取出培養(yǎng)液在倒置光學(xué)顯微鏡 400 倍下觀察細(xì)胞狀態(tài)并拍照。

1.2.2MTT法測(cè)細(xì)胞增殖抑制率: 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)活躍期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞使其濃度在2×105個(gè)/mL左右，將其加入到96孔板中，每孔各100μL。隨后將抗菌肽defensin分別加到實(shí)驗(yàn)組孔位中，使其終濃度分別為30、60、120、360、680和1 000 μg/mL。每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后使腫瘤細(xì)胞貼壁?？瞻卓捉M設(shè)4個(gè)復(fù)孔，每孔PBS 100 μL。將孔板放置37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄液，每孔加入 MTT 20 μL(5 mg/mL)，放置培養(yǎng)箱中，4 h之后每孔加入二甲基亞砜(DMSO) 100 μL，在37℃搖床上震搖10 min后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm時(shí)的吸光值。根據(jù)以下公式求出抗菌肽各濃度的相對(duì)抑制率(IR)。

1.2.3MTT比色法測(cè)定不同濃度抗菌肽作用下細(xì)胞生長(zhǎng)曲線: 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)活躍期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為(0.5～5.0)×105/mL。在每孔中加入 100 μL的細(xì)胞懸液，置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。在其中加入不同濃度的抗菌肽defensin培養(yǎng)液 100 μL，陰性對(duì)照組中加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)5 d。每個(gè)濃度組每天各取6孔，在每孔中加入5 mg/mL的 MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入 200 μL的DMSO，溫箱中培養(yǎng)30 min，在450 nm處測(cè)定吸光度值。根據(jù)測(cè)定值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.4用Annexin v-Fitc凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞凋亡率: 用1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×106/mL的細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液加入24孔板中，800 μL/孔，將不同濃度抗菌肽加入靶細(xì)胞中，400 μL/孔，剩余孔板中加PBS作為對(duì)照，各設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，放入37℃, 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。用PBS洗滌細(xì)胞兩次(2 000 r/min離心5 min)收集濃度為1～5×105的細(xì)胞；在加入500 μL的 Binding Buffer緩沖液(hepes(10 mmol/L)/NaOH(PH 7.4),NaCl(140 mmol/L),CaCl2(2.5 mmol/L))，在500 μL 的Binding Buffer緩沖液中加入5 μL Annexin V-FITC，5 μL Propidium Iodide(碘化丙啶)，混勻。室溫避光反應(yīng)5～15 min；1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測(cè)。

1.2.5用細(xì)胞周期試劑盒檢測(cè)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期: 調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入4 mL培養(yǎng)液，將細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24 h，去上清，加入2 mL抗菌肽和l mL培養(yǎng)基混合物，在陰性對(duì)照組中加入2 mL PBS和l mL培養(yǎng)基。每個(gè)濃度組各設(shè)置3瓶。在加抗菌肽48 h后收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞1次(離心2 000 r/min，5 min)后收集并調(diào)整細(xì)胞濃度；之后用70%乙醇固定細(xì)胞懸液，在4℃冰箱中保存，4 h后進(jìn)行染色；細(xì)胞懸液用200目篩網(wǎng)過(guò)濾1次；加100 μL RNase A 37℃水浴箱中水浴30 min；再加入400 μL PI染液進(jìn)行染色混勻，4℃避光30 min；上機(jī)檢測(cè)，記錄激發(fā)波長(zhǎng)488 nm 處的紅色熒光。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 SPSS13.0軟件包處理，用實(shí)驗(yàn)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan進(jìn)行兩兩比較。細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)用該軟件得出回歸方程和IC50，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05?？咕腗D對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的caspase-3含量的影響數(shù)據(jù)采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡觀察檢測(cè)defensin抗腫瘤細(xì)胞HepG2結(jié)果

將defensin蛋白作用于肝癌細(xì)胞HepG2，在實(shí)驗(yàn)組中加入 680 μg/mL蛋白48 h，它的作用結(jié)果如圖1(A, B)所示，實(shí)驗(yàn)組B中的細(xì)胞嚴(yán)重受損，細(xì)胞胞膜不完整，細(xì)胞內(nèi)容物外泄，基本已看不到完整的細(xì)胞。而對(duì)照組A中細(xì)胞則比較規(guī)整。

圖1 倒置顯微鏡觀察檢測(cè)defensin抗腫瘤細(xì)胞HepG2結(jié)果Fig.1 Results of defensin on tumor cell HepG2 by inverted microscopeA. 陰性對(duì)照組(HepG2)(×400)；B. Defensin作用組(HepG2)(×400)。A. Negative control group(HepG2)(×400)；B. Treatment group(HepG2)(×400).

2.2 MTT法檢測(cè)抗菌肽defensin對(duì)人心肌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的抑制作用

從表1中可以看出，不同濃度組抗菌肽defensin對(duì)人心肌細(xì)胞H9C2抑制率較低，各個(gè)濃度組抗菌肽defensin與正常對(duì)照組實(shí)際OD值相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

如表2六個(gè)濃度組的抗菌肽defensin均對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2有抑制作用，各濃度抗菌肽實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高濃度組(120、360、680、1 000 μg/mL組)與其他低濃度組相比較差異具有顯著性，其結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組的抑制率隨濃度的增加逐漸上升，具有劑量效應(yīng)反應(yīng)關(guān)系。

表1 抗菌肽對(duì)人心肌細(xì)胞的抑制作用 (n=6)Tab.1 Inhibitional effect on HCM cell by antimicrobial peptides MD

注: 同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異無(wú)顯著性(P>0.05，鄧肯新復(fù)級(jí)差檢測(cè))。以下表中字母意義相同。

Note: Within each column, values followed by the different letter are significantly different (P<0.05，Duncan’s new multiple differential detection). The same below.

表2 抗菌肽defensin對(duì)腫瘤細(xì)胞HepG2的抑制作用(n=6)Tab.2 Inhibitional effect on HepG2 cell by antimicrobial peptides defensin

2.3 抗菌肽defensin作用下HepG2的生長(zhǎng)情況

從圖2中可以看出，肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)活躍繁殖期是第1天，各抗菌肽defensin濃度組在實(shí)驗(yàn)早期對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)就產(chǎn)生抑制作用，隨著抗菌肽defensin濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抗菌肽defensin對(duì)細(xì)胞的抑制殺傷作用顯著增強(qiáng)。

圖2 各濃度組抗菌肽作用下HepG2腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)作用曲線Fig.2 Growth curve of HepG2 tumor cells under different concentration of antimicrobial peptides

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗菌肽defensin作用于肝癌細(xì)胞HepG2所引起的細(xì)胞凋亡

如表3圖3所示，各濃度組中680和1 000 μg/mL的抗菌肽defensin作用組對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2有一定的抑制殺傷作用，細(xì)胞壞死和凋亡組與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該抗菌肽defensin可以有效地抑殺肝癌細(xì)胞HepG2。

圖3 經(jīng)家蠅抗菌肽defensin不同濃度處理后凋亡率的測(cè)定Fig.3 The cell apoptotic rate by the flow cytometry analysis after treatment with different concentration of defensina. 對(duì)照組; b. 120 μg/mL處理組; c. 680 μg/mL處理組; d. 1 000 μg/mL處理組。a. Control; b. 120 μg/mL treatment group; c. 680 μg/mL treatment group; d. 1 000 μg/mL treatment group.

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞周期

從表4和圖4中可以看出，各濃度組抗菌肽defensin作用組使肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞的S期降低，并且G0/G1期有所升高，從而引起細(xì)胞增殖指數(shù)PI降低，這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正常對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。因此可以說(shuō)該抗菌肽defensin可使肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，從而抑制了S期DNA的合成。

表3 不同濃度抗菌肽作用下HepG2細(xì)胞凋亡結(jié)果Tab.3 apoptosis of HepG2 under different concentration antimicrobial

表4 抗菌肽對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響Tab.4 Effect of the antimicrobial Peptide on cell cycle of HepG2 cell

圖4 經(jīng)家蠅抗菌肽defensin不同濃度作用處理后細(xì)胞周期的測(cè)定Fig.4 The cell cycle result by the flow cytometry analysis after treatment with different concentration of defensina. 對(duì)照組; b. 120 μg/mL處理組; c. 680 μg/mL處理組; d. 1 000 μg/mL處理組。a. Control; b. 120 μg/mL group; c. 680 μg/mL group; d. 1 000 μg/mL group.

3 討論

肝癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，在中國(guó)統(tǒng)計(jì)年鑒報(bào)道中居于癌癥發(fā)病率第2位。它和其他惡性腫瘤細(xì)胞一樣，主要是細(xì)胞增殖過(guò)度，而在細(xì)胞凋亡信號(hào)通路受阻時(shí)所造成的異型細(xì)胞無(wú)限制地過(guò)度增長(zhǎng)，從而引起相關(guān)的病理生理變化。臨床上用來(lái)治療肝癌的藥物有的雖然有效，但是引起的不良反應(yīng)和副作用往往使病人難以忍受，有的甚至引起并發(fā)癥;然而抗菌肽在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞的作用比較小，因此這個(gè)原因就成為我們研究抗菌肽的焦點(diǎn)。昆蟲(chóng)防御素(Insect defensin)主要作用于病菌細(xì)胞膜，使病菌不易產(chǎn)生對(duì)防御素的抗性(Leeetal., 2002),但其它短肽主要作用于病原生物的酶物質(zhì)，但酶基因會(huì)產(chǎn)生突變。一旦突變就會(huì)使目的細(xì)胞對(duì)這些短肽產(chǎn)生抗性，而防御素卻具有其它肽類所沒(méi)有的優(yōu)點(diǎn)，它不會(huì)使靶細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生抗性。機(jī)體免疫系統(tǒng)也可以通過(guò)防御素來(lái)調(diào)節(jié)，能夠抗感染。我們通過(guò)顯微鏡觀察法檢測(cè)到純化目的蛋白defensin對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞具有抑制殺傷作用，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)該蛋白的抑菌活性有所研究，本實(shí)驗(yàn)采用MTT法測(cè)定抗菌肽defensin對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的抑制率，MTT比色法具有特異性較強(qiáng)、靈敏度較高、速度較快、準(zhǔn)確性好及重復(fù)性好的特點(diǎn)，在客觀基礎(chǔ)上與常用的傳統(tǒng)的方法相比具有很大的優(yōu)點(diǎn)(Mosmannetal.,1983)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示6個(gè)濃度組的抗菌肽defensin對(duì)腫瘤細(xì)胞HepG2有抑制作用，各組與正常對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且高濃度組與低濃度組 (30 μg/mL組)相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而且隨著濃度的增加它對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率逐漸上升，呈劑量效應(yīng)反應(yīng)關(guān)系。人心肌細(xì)胞H9C2各濃度組與正常對(duì)照組相比差異不具有顯著性(P>0.05)，說(shuō)明我們所提取的家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽defensin對(duì)腫瘤細(xì)胞HepG2具有抑制作用，而對(duì)正常人心肌細(xì)胞H9C2基本無(wú)抑制作用。這與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的抗菌肽對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制作用，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒性作用結(jié)果相一致。趙瑞君等(2007)利用家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽作用于人髓樣白血病細(xì)胞株K562、人淋巴瘤細(xì)胞株Daudi、人食管癌細(xì)胞株Eca109和人膀胱癌細(xì)胞株T24，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明4種腫瘤細(xì)胞都受到不同程度的損傷。

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是用來(lái)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)，增殖的常用指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)采用MTT比色法測(cè)定繪制不同濃度家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽作用下HepG2腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期在第1天，隨著藥物作用時(shí)間的加長(zhǎng)和濃度的增強(qiáng)細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，且高濃度組抗菌肽對(duì)細(xì)胞的抑制作用明顯高于其他濃度組。腫瘤細(xì)胞HepG2在不同濃度抗菌肽defensin作用下的生長(zhǎng)曲線顯示家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽defensin對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用隨著時(shí)間加長(zhǎng)和濃度的遞增而逐步加強(qiáng)。

賀莉芳等(2006)采用家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽在體外誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞JEC凋亡，他的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示證明高濃度組家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽可以引起細(xì)胞凋亡，并且子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞JEC細(xì)胞的凋亡率顯著升高，所以該實(shí)驗(yàn)結(jié)果能推測(cè)出家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽可以通過(guò)某些途徑來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而達(dá)到抑殺腫瘤細(xì)胞的效果。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示680和1 000 μg/mL抗菌肽defensin對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的作用，顯示和它與正常對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此說(shuō)明抗菌肽defensin可能通過(guò)某種途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡而用來(lái)殺傷細(xì)胞。

王芳等(1998)研究鱟抗菌肽對(duì)人肝癌細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的作用中發(fā)現(xiàn)，鱟抗菌肽能阻止細(xì)胞生長(zhǎng)在G0/G1期，并上調(diào)P16蛋白和P21mRNA，下調(diào)突變型P53蛋白，細(xì)胞周期蛋白D1和CDK4蛋白及c-myc mRNA。劉文釗等(2008)利用家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽作用于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞JEc和黑色素瘤細(xì)胞A375，該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)JEC細(xì)胞在2.5%和12.5%抗菌肽組作用下G0/G1期下降;高濃度組(12.5%)引起A375細(xì)胞在G0/G1期下降，GI/M期及PI有顯著升高。我們從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中能夠看到，抗菌肽使大量的細(xì)胞在G1期停滯，且不能進(jìn)入S期，從而抑制了S期DNA合成，說(shuō)明抗菌肽可通過(guò)影響細(xì)胞周期作用來(lái)發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞HepG2的作用。

本研究從形態(tài)學(xué)著手觀察，純化蛋白defensin能夠誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡，抑制其增殖，并且該蛋白對(duì)正常人心肌細(xì)胞H9C2無(wú)抑殺作用。該蛋白通過(guò)影響細(xì)胞周期作用來(lái)發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞HepG2的作用，但是純化蛋白defensin對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2誘導(dǎo)凋亡發(fā)生機(jī)制及對(duì)其他腫瘤細(xì)胞作用效果仍需進(jìn)一步探討和研究。