• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    恙蟲病東方體合肥分離株截短56 kDa蛋白抗原表達(dá)及活性分析*

    2014-11-10 02:00:14耿美玲郝麗娜張鳳玉龔秀芳李丙軍李先富潘秀珍王長軍
    關(guān)鍵詞:恙蟲合肥抗原

    耿美玲 鄭 峰 呂 恒 朱 進(jìn) 胡 丹 郝麗娜 張鳳玉龔秀芳 李丙軍 李先富 潘秀珍 王長軍** 操 敏**

    (1.南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所,南京210002;2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,南京210046)

    恙蟲病是由恙蟲病東方體Orientiatsutsugamushi引起的蟲媒傳染病和自然疫源性疾病,鼠類為主要傳染源,通過恙螨幼蟲叮咬傳播。恙蟲病東方體的56 kDa蛋白是菌體主要外膜蛋白(Stoveretal.,1990),因其暴露菌體表面、含量豐富以及最常為宿主免疫系統(tǒng)識別等特點(diǎn),因此作為很好的診斷抗原候選者,在ELISA、免疫層析、PCR、qPCR和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)等診斷方法中得到廣泛應(yīng)用(Kimetal.,2011; Blackselletal.,2012);56 kDa蛋白作為型特異性蛋白,對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增、結(jié)合限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析或測序能將東方體分成不同的基因型(郭恒彬等,1997);東方體56 kDa蛋白還被證實(shí)與東方體粘附及侵入宿主細(xì)胞能力密切有關(guān), 在L929細(xì)胞培養(yǎng)過程中加入Boryong 株56 kDa重組抗原免疫的小鼠血清,其吸附和生長分別降低了96 %和91 %(Leeetal.,2008)。此外,56 kDa蛋白還是制備亞單位疫苗的較為理想的候選分子,研究報道Boryong 株56 kDa重組抗原可誘導(dǎo)對同源株的細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng), 保護(hù)小鼠抵抗同源株的再攻擊(Seongetal., 1997a)。攜帶Karp 株東方體56 kDa 抗原基因的DNA疫苗,免疫小鼠獲得部分同源保護(hù)作用(Nietal., 2005)。不同株型東方體56 kDa蛋白存在差異,本研究將含有440個氨基酸的合肥株56 kDa截短蛋白(Qt56)序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹及抗原性分析,同時將其基因在原核系統(tǒng)克隆表達(dá),親和層析法純化目的蛋白,Western-blot及ELISA法鑒定其免疫學(xué)活性,為進(jìn)一步研制廣譜診斷試劑、疫苗以及分析其在東方體致病的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 質(zhì)粒和菌株

    表達(dá)質(zhì)粒pET28a為Novage公司產(chǎn)品。大腸桿菌E.coliBL21為本實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.2 試劑

    PCR擴(kuò)增試劑盒、DNA Marker、質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ T4連接酶均為TaKaRa公司產(chǎn)品。DNA 割膠回收試劑盒購自Promega公司, 蛋白Marker為Fermentas公司產(chǎn)品。HRP標(biāo)記的鼠抗人IgG、鄰苯二胺(DAB)顯色液和TMB顯色液購于武漢博士德生物工程有限公司。

    1.3 序列分析

    在GenBank protein 數(shù)據(jù)庫中,以O(shè).tsutsugamushi為關(guān)鍵詞檢索目的序列。利用Mega 5.0軟件包中的ClustalW對3株國際標(biāo)準(zhǔn)株(Karp、Kato、Gilliam),5株常見株(Kawassaki、Shimokoshi、Kuroki、Yonchon、Boryong), 及國內(nèi)常見株(Hefei、Guangzhou、Shandong、Neimeng、Taiwan、Ptan)的蛋白進(jìn)行序列分析。

    使用DNAStar軟件中的Protean,使用DNAstar軟件中的protean對上述中的14條蛋白序列進(jìn)行親水性、溶解性及抗原性分析。

    1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

    將實(shí)驗(yàn)室前期制備的恙蟲病東方體合肥株56 kDa截短蛋白基因的PCR產(chǎn)物用DNA回收試劑盒回收純化后,用EcoRⅠ 和BamHⅠ雙酶切,回收純化后與同樣經(jīng)雙酶切后回收純化的質(zhì)粒PET28a連接,構(gòu)建帶有HisTag的重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21,涂布含卡那霉素(100 mg/mL)LB平板,置37℃過夜。次日隨機(jī)挑取若干個菌落,分別提取質(zhì)粒,PCR鑒定,陽性者進(jìn)一步同時用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,電泳檢測切出約1 320 bp基因片段的質(zhì)粒判斷為陽性重組質(zhì)粒.

    1.5 重組蛋白的表達(dá)和純化

    重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliBL21,菌液擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600約為0.6時,100 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)4 h,15%SDS-PAGE 電泳檢測是否有目的蛋白的表達(dá)。將重組體擴(kuò)大培養(yǎng)并經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá),離心收集菌體, PBS 重懸后冰浴超聲破碎菌體,離心后的上清過濾,用Ni2+離子親和層析柱純化蛋白,并進(jìn)行蛋白復(fù)性。

    1.6 Western blot 鑒定

    將含有恙蟲病東方體合肥株56 kDa截短蛋白重組質(zhì)粒的重組菌在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),同時設(shè)空質(zhì)粒菌為對照。離心收集菌體, 超聲破碎,將全菌裂解物分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳,采用電轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h;加人抗恙蟲病東方體蛋白的血清(1∶200),37℃孵育1 h;用HRP 標(biāo)記的鼠抗人IgG (1∶4000)37℃孵育1 h;加DAB顯色液顯色。

    1.7 ELISA分析

    東方體56 kDa截短蛋白基因工程抗原用包被液分別稀釋為5 μg/mL,每孔包被100 μL于96 孔酶標(biāo)板上,置于4 ℃過夜包被,PBST 洗3次后,用5 %的脫脂奶粉于37 ℃封閉2 h,病人血清分別以1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600稀釋,同時用人的正常血清作對照,37℃孵育1 h, PBST 洗3次,加入100 μL抗人IgG-HRP(1∶4000),37 ℃孵育30 min,用PBST洗凈,甩干,滴加TMB 顯色,約10 min 后滴加 2 mol/L H2SO4終止,于酶標(biāo)儀450 nm 檢測OD 值。以不同濃度(5 000、1 000、500、100、80、60、40 ng/mL)的東方體56 kDa截短蛋白基因工程抗原每孔包被100 μL于包被96 孔酶標(biāo)板,置于4 ℃過夜包被,PBST洗3次后,用5 %的脫脂奶粉于37 ℃封閉2 h,而病人血清以1∶100、1∶200稀釋,同時用人的正常血清作對照,37℃孵育1 h, PBST 洗3次,加入100 μL抗人IgG-HRP(1∶4000),37 ℃孵育30 min,用PBST 洗凈,甩干,滴加TMB 顯色,約10 min 后滴加 2 mol/L H2SO4終止,于酶標(biāo)儀450 nm 檢測OD 值。

    2 結(jié)果

    2.1 序列對比結(jié)果

    利用Megalign及Vector NTI軟件分析,可看出恙蟲病東方體合肥株56 kDa截短蛋白包含有完整蛋白的3個可變區(qū),分別為:VDⅠ(64-92)、VDⅡ(137-157)、VDⅢ(342-357)(圖1)。

    2.2 序列抗原性與理化特性分析結(jié)果

    經(jīng)DNAStar分析,發(fā)現(xiàn)在合肥株東方體56 kDa截短蛋白氨基酸序列的4個保守區(qū)親水性曲線,抗原性曲線均呈現(xiàn)較高值(圖2)。

    圖1 14條Ot56氨基酸序列相似性分析Fig. 1 Similarity analysis of 14 Ot56 amino acid sequences

    圖2 Ot56 氨基酸理化特性分析曲線Fig. 2 Physical and chemical characteristic of amino acid Ot 56 sequence

    2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

    重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增及BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切鑒定,1%瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR產(chǎn)物和酶切片段 約1 320 bp,與目的基因大小相符(圖3)。對陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行序列分析,結(jié)果顯示克隆的靶基因與已測序的該段合肥株東方體56 kDa部分基因序列完全一致。

    圖3 重組質(zhì)粒PET28a::tHefei雙酶切鑒定Fig. 3 Identification of the recombinant plasmid PET28a::tHefei digested by double restriction enzymesM: 250 bp DNA Marker;1:重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定;2:重組質(zhì)粒; 3:重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切。M: 250 bp DNA Marker; 1: Identification by PCR; 2: The recombinant plasmid; 3: The plasmid digested by BamHⅠ and EcoRⅠ.

    2.4 目的蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)及純化

    SDS-PAGE 表明,含重組表達(dá)質(zhì)粒的E.coliBL21 經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后在55 kDa左右處有一條明顯的蛋白條帶,分子量大小與預(yù)期一致。利用His 親和層析柱對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步純化,電泳可見一條特異的蛋白條帶,表明得到了較高純度重組蛋白(圖4)。

    圖4 SDS-PAGE 檢測蛋白表達(dá)和純化Fig. 4 Expression and purification analysis of recombinant protein SDS-PAGEM:Marker;1: pET28a空質(zhì)粒;2:未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒;3:IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒;4:純化蛋白。M:Protein marker; 1:pET28a/BL21; 2: pET28a::tHefei 56kd /BL21 without IPTG induction; 3:pET28a:: tHefei 56kd/BL21 induced with IPTG;4: Purified recombinant protein.

    2.5 Western Blot 分析

    Western blot 結(jié)果顯示,重組目的蛋白可以與恙蟲病病人血清發(fā)生特異性反應(yīng),在約55 kDa 處出現(xiàn)明顯的條帶(圖5),表明重組蛋白具有特異的免疫反應(yīng)活性。

    圖5 Western blot 分析Fig. 5 Analysis of western blotA.正常人血清;B.恙蟲病人血清。M: Marker;1,2: 純化蛋白。A. Negative serum;B. Patient’s positive serum. M:Marker;1,2: Recombinant protein.

    2.6 ELISA分析

    以5 μg/mL合肥株東方體重組抗原濃度包被,稀釋度為1∶12 800病人血清仍可以檢出陽性(圖6),合肥株東方體重組抗原濃度最低為80 ng/mL時仍可有效區(qū)分陰陽性血清(圖7),表明目的蛋白有較強(qiáng)免疫活性。陽性判定標(biāo)準(zhǔn):P/N值(陽性孔OD值/陰性孔OD值)大于或等于2.1為陽性。

    圖6 不同濃度恙蟲病人血清的抗體效價Fig 6 The titer of different concentrations of patients ‘serum

    圖7 不同抗原濃度的抗體效價Fig.7 The titer of different concentration of antigenHefei A:恙蟲病人血清濃度1∶100;Control A:正常人血清濃度1∶100;Hefei B: 恙蟲病人血清濃度1∶200;Control B: 正常人血清濃度1∶200。Hefei A:Patients’serum concentration 1∶100;Control A:Negative serum concentration 1∶100;Hefei B:Patients’serum concentration 1∶200; Control B:Negative serum concentration 1∶200.

    3 討論

    恙蟲病東方體56 kDa蛋白在東方體的分型、診斷、疫苗研制及致病分子機(jī)制研究中均有重要作用(左小華等,2010)。根據(jù)針對56 kDa蛋白的分子生物學(xué)分型方法,在世界范圍內(nèi)至少已報道有超過30種抗原型別不同的東方體。本課題組前期已對合肥株56 kDa蛋白的基因進(jìn)行過分析(操敏等,2013),本研究對該部分56 kDa蛋白經(jīng)DNAStar分析,發(fā)現(xiàn)在VDⅠ(64-92)、VDⅡ(137-157)、VDⅢ(342-357)為變異區(qū),其余為保守區(qū),與Ohashi 等(1992)等對Kato、Kawasiki、Shimokoshi、Gilliam、Karp 和Kuorki 6 條不同血清型的Ot 56 序列分析結(jié)果類似,與劉昌政(2008)等分析的氨基酸的5個高可變區(qū)和6個高保守區(qū)也相符。早在1997年Seong等(1997b)就發(fā)現(xiàn)Boryong株氨基酸的19~113、142~203、和243~328 等3個區(qū)域具有強(qiáng)的抗原反應(yīng)性,而接著Choi等(1999)又發(fā)現(xiàn)該序列的393~432區(qū)域也具有抗原反應(yīng)性。本研究發(fā)現(xiàn)56 kDa截短蛋白氨基酸序列的4個保守區(qū)ADⅠ(1-64)、 ADⅡ(93-136)、ADⅢ(158-341)、ADⅣ(358-440)處親水性線,抗原性曲線均呈現(xiàn)較高值,提示其可作為診斷、疫苗等設(shè)計的靶點(diǎn)。合肥株截短56 kDa蛋白基因包含3個可變區(qū)和大部分穩(wěn)定區(qū)長約1 350 bp基因序列,含與同型和異型抗體反應(yīng)的抗原表位區(qū)域,將其與表達(dá)載體PET28a 6個組氨酸尾融合表達(dá),得到了穩(wěn)定表達(dá)。SDS-PAGE電泳證明誘導(dǎo)后的蛋白表達(dá)顯著,產(chǎn)物經(jīng)鎳(Ni2+)柱親和層析純化后復(fù)性得到目的蛋白。免疫印跡和ELISA結(jié)果證實(shí),純化蛋白能被患者血清所識別,與健康正常人血清不起作用,表明其能夠有效區(qū)分恙蟲病陽性和陰性血清,稀釋到 80 ng/mL的合肥重組抗原仍可檢測陽性血清,具有良好的抗原性,可作為重組抗原取代天然抗原作為診斷抗原,達(dá)到經(jīng)濟(jì)、特異和安全的目的。

    本課題組近年來研制了以東方體平潭株和Gilliam株基因工程抗原混合為診斷抗原的恙蟲病膠體金快速診斷試劑(Caoetal.,2007),適用于基層部隊(duì)及疫區(qū)現(xiàn)場快速檢測。但有研究報道東方體抗原對同型抗體能起較強(qiáng)反應(yīng),而對異型抗體反應(yīng)微弱甚至不起反應(yīng)(Ohashietal.,1988; Choietal.,1999;Kimetal., 2013)。因此,將不同東方體型別抗原混合作為診斷抗原,可能將有利于進(jìn)一步提高該試劑的敏感性,擴(kuò)大其檢測譜。本研究獲得的重組抗原,有望與其他型別56 kDa蛋白混合作為重組抗原制備廣譜的恙蟲病膠體金快速診斷試劑盒,或單獨(dú)作為診斷抗原,制備具有地域特點(diǎn)的診斷試劑。同時,還可進(jìn)一步用于恙蟲病的疫苗制備,分子致病機(jī)制的等研究。

    猜你喜歡
    恙蟲合肥抗原
    合肥的春節(jié)
    恙蟲病實(shí)驗(yàn)室診斷研究進(jìn)展
    傳染病信息(2021年6期)2021-02-12 01:52:12
    春夏季戶外謹(jǐn)防與小蟲“親密接觸”
    自我保健(2019年5期)2019-08-02 03:54:24
    合肥:打造『中國IC之都』
    老年恙蟲病并多器官損害1例
    梅毒螺旋體TpN17抗原的表達(dá)及純化
    結(jié)核分枝桿菌抗原Lppx和MT0322人T細(xì)胞抗原表位的多態(tài)性研究
    血必凈對恙蟲病并發(fā)多器官功能障礙患者的保護(hù)作用
    APOBEC-3F和APOBEC-3G與乙肝核心抗原的相互作用研究
    生態(tài)合肥
    母亲3免费完整高清在线观看| 黄色 视频免费看| 国产日韩欧美视频二区| videos熟女内射| 黄色视频在线播放观看不卡| 纯流量卡能插随身wifi吗| 日本91视频免费播放| 欧美 日韩 精品 国产| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 大香蕉久久网| cao死你这个sao货| 99久久精品国产亚洲精品| www.精华液| 日日夜夜操网爽| 欧美乱码精品一区二区三区| 97人妻天天添夜夜摸| 国产视频一区二区在线看| 精品福利观看| 涩涩av久久男人的天堂| 日韩三级视频一区二区三区| a级毛片在线看网站| 免费在线观看黄色视频的| 美女扒开内裤让男人捅视频| 午夜91福利影院| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 久久久精品区二区三区| 精品一品国产午夜福利视频| 久久久国产欧美日韩av| 人妻一区二区av| 中文字幕人妻丝袜制服| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 2018国产大陆天天弄谢| netflix在线观看网站| 亚洲精品第二区| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 亚洲第一青青草原| 亚洲精品一二三| 成人免费观看视频高清| 久久性视频一级片| 午夜老司机福利片| 久久久久精品国产欧美久久久 | 性色av一级| videos熟女内射| 国产精品二区激情视频| 亚洲精华国产精华精| 日本wwww免费看| 91大片在线观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产精品一二三区在线看| 精品亚洲成国产av| 国产三级黄色录像| 99精国产麻豆久久婷婷| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美少妇被猛烈插入视频| 中文字幕最新亚洲高清| 免费日韩欧美在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 日韩三级视频一区二区三区| 香蕉国产在线看| 婷婷丁香在线五月| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 淫妇啪啪啪对白视频 | 午夜福利乱码中文字幕| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲综合色网址| 中文字幕av电影在线播放| 97精品久久久久久久久久精品| 丁香六月天网| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲精品国产av成人精品| 欧美 日韩 精品 国产| 好男人电影高清在线观看| 日韩视频在线欧美| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 久久热在线av| 97人妻天天添夜夜摸| 波多野结衣av一区二区av| 国产av一区二区精品久久| 精品国产一区二区三区久久久樱花| a在线观看视频网站| 黄色片一级片一级黄色片| 丰满迷人的少妇在线观看| 91老司机精品| 国产亚洲欧美精品永久| 在线av久久热| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲av男天堂| 久久久久视频综合| 久久热在线av| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 精品一区二区三区四区五区乱码| 男女高潮啪啪啪动态图| 午夜激情av网站| 男女无遮挡免费网站观看| 天堂中文最新版在线下载| 一本色道久久久久久精品综合| 人妻人人澡人人爽人人| 一区福利在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 热99国产精品久久久久久7| 男人舔女人的私密视频| 黄色视频不卡| 日韩有码中文字幕| 国产av国产精品国产| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 精品国产乱码久久久久久男人| 视频区图区小说| 精品第一国产精品| 韩国高清视频一区二区三区| 久久亚洲国产成人精品v| 老鸭窝网址在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| av国产精品久久久久影院| 亚洲三区欧美一区| 精品乱码久久久久久99久播| 大香蕉久久成人网| 人人澡人人妻人| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲精品一二三| 国产精品 国内视频| 少妇的丰满在线观看| 久久久久久久久免费视频了| 婷婷色av中文字幕| 午夜福利,免费看| 男人操女人黄网站| 亚洲成人手机| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲少妇的诱惑av| 91成年电影在线观看| 美女主播在线视频| 我的亚洲天堂| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 老汉色av国产亚洲站长工具| 永久免费av网站大全| 国产麻豆69| 日日夜夜操网爽| 婷婷色av中文字幕| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 视频在线观看一区二区三区| 国产高清videossex| 国产男人的电影天堂91| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 制服人妻中文乱码| 欧美国产精品va在线观看不卡| 久久人人97超碰香蕉20202| 欧美黑人欧美精品刺激| 中文字幕人妻熟女乱码| 色播在线永久视频| 亚洲 国产 在线| 天天添夜夜摸| 日韩大片免费观看网站| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 免费黄频网站在线观看国产| 叶爱在线成人免费视频播放| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲专区字幕在线| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久精品国产综合久久久| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久免费观看电影| 高清在线国产一区| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产成人系列免费观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 欧美久久黑人一区二区| 韩国高清视频一区二区三区| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲国产av新网站| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产亚洲av高清不卡| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产精品 国内视频| www.熟女人妻精品国产| 曰老女人黄片| 午夜福利,免费看| 国产黄色免费在线视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 动漫黄色视频在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 中文字幕人妻熟女乱码| 人妻人人澡人人爽人人| h视频一区二区三区| 老司机影院毛片| 视频区图区小说| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产成人系列免费观看| 久久久国产精品麻豆| 成在线人永久免费视频| 91麻豆av在线| 欧美性长视频在线观看| 午夜免费观看性视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲黑人精品在线| 一级片'在线观看视频| 一本大道久久a久久精品| 在线观看一区二区三区激情| 一级,二级,三级黄色视频| 国产人伦9x9x在线观看| 国产精品久久久久久精品古装| 蜜桃在线观看..| 电影成人av| 伦理电影免费视频| 亚洲全国av大片| 老汉色av国产亚洲站长工具| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 精品免费久久久久久久清纯 | 欧美性长视频在线观看| 久久久国产成人免费| 久久香蕉激情| 色综合欧美亚洲国产小说| 1024视频免费在线观看| 十八禁人妻一区二区| 最黄视频免费看| 各种免费的搞黄视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 日本av手机在线免费观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久99热这里只频精品6学生| 9191精品国产免费久久| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲欧美激情在线| 蜜桃国产av成人99| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 欧美性长视频在线观看| 国产亚洲av高清不卡| 久久国产精品大桥未久av| 久久久国产一区二区| 国产成人欧美| 又大又爽又粗| 亚洲国产精品成人久久小说| 91成年电影在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 99精品久久久久人妻精品| 丝袜脚勾引网站| 亚洲中文av在线| 高清在线国产一区| 国产成人系列免费观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲精品中文字幕在线视频| 免费看十八禁软件| 岛国在线观看网站| 99精国产麻豆久久婷婷| 黄色毛片三级朝国网站| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲欧美激情在线| 天天操日日干夜夜撸| 日日夜夜操网爽| 国产成人精品在线电影| 久久午夜综合久久蜜桃| 精品亚洲成国产av| 大型av网站在线播放| 制服人妻中文乱码| 国产真人三级小视频在线观看| 久9热在线精品视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 亚洲精品国产精品久久久不卡| 两人在一起打扑克的视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲国产av新网站| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 母亲3免费完整高清在线观看| netflix在线观看网站| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 亚洲综合色网址| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 欧美精品一区二区免费开放| 又紧又爽又黄一区二区| 久久99一区二区三区| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 亚洲情色 制服丝袜| 纯流量卡能插随身wifi吗| 午夜福利,免费看| 国产福利在线免费观看视频| 男男h啪啪无遮挡| 成人三级做爰电影| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产视频一区二区在线看| 亚洲av美国av| 欧美成狂野欧美在线观看| svipshipincom国产片| svipshipincom国产片| 91精品伊人久久大香线蕉| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲人成77777在线视频| 成人国语在线视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 欧美在线黄色| 一级,二级,三级黄色视频| 国产高清国产精品国产三级| 飞空精品影院首页| 99精国产麻豆久久婷婷| 欧美另类亚洲清纯唯美| 秋霞在线观看毛片| 男女床上黄色一级片免费看| 女警被强在线播放| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 国产精品成人在线| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 中亚洲国语对白在线视频| 超碰成人久久| 国产av精品麻豆| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲久久久国产精品| 正在播放国产对白刺激| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 欧美另类一区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 99久久国产精品久久久| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 99热国产这里只有精品6| 一区二区三区激情视频| 丝袜人妻中文字幕| 久热爱精品视频在线9| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 欧美国产精品va在线观看不卡| 99精国产麻豆久久婷婷| 精品少妇久久久久久888优播| 宅男免费午夜| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 精品人妻在线不人妻| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产麻豆69| 久久久久久久国产电影| 人人妻人人澡人人看| 老司机靠b影院| 人成视频在线观看免费观看| 老司机影院成人| 免费高清在线观看日韩| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 热re99久久国产66热| 啦啦啦 在线观看视频| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲,欧美精品.| 午夜成年电影在线免费观看| 男女无遮挡免费网站观看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 丁香六月欧美| 搡老岳熟女国产| 国产福利在线免费观看视频| 一区二区三区四区激情视频| 国产淫语在线视频| 成人手机av| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲视频免费观看视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 啦啦啦啦在线视频资源| 日本a在线网址| 亚洲国产精品一区三区| 自线自在国产av| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久ye,这里只有精品| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 精品福利永久在线观看| 人人澡人人妻人| 午夜影院在线不卡| 香蕉国产在线看| 午夜福利影视在线免费观看| 宅男免费午夜| 国产成人欧美在线观看 | 一区在线观看完整版| 无限看片的www在线观看| 99国产精品免费福利视频| 国产男人的电影天堂91| 久热这里只有精品99| 国产男女内射视频| 国产免费av片在线观看野外av| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | h视频一区二区三区| 午夜激情久久久久久久| 少妇精品久久久久久久| 久久久久视频综合| 久久狼人影院| 欧美国产精品一级二级三级| 国产免费av片在线观看野外av| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久久国产一区二区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲欧洲日产国产| 黄片小视频在线播放| 久久国产精品人妻蜜桃| 日韩三级视频一区二区三区| 久久 成人 亚洲| 五月开心婷婷网| 国产成人免费无遮挡视频| 91成年电影在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 满18在线观看网站| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| a在线观看视频网站| 亚洲精品在线美女| 在线观看免费午夜福利视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 久久久国产欧美日韩av| 国产精品免费大片| 欧美激情 高清一区二区三区| 青青草视频在线视频观看| 男女床上黄色一级片免费看| 一区二区三区四区激情视频| 国产精品一区二区在线观看99| 黑人操中国人逼视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 欧美性长视频在线观看| 中国美女看黄片| 韩国高清视频一区二区三区| 免费在线观看黄色视频的| 国产精品影院久久| 亚洲综合色网址| 少妇被粗大的猛进出69影院| 两个人看的免费小视频| 国产欧美亚洲国产| 丰满少妇做爰视频| 亚洲黑人精品在线| 亚洲精品在线美女| 国产麻豆69| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 高清在线国产一区| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲国产欧美网| 天堂中文最新版在线下载| 精品福利观看| 后天国语完整版免费观看| 国产高清视频在线播放一区 | 美女午夜性视频免费| √禁漫天堂资源中文www| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲精品国产精品久久久不卡| netflix在线观看网站| 性色av乱码一区二区三区2| 色老头精品视频在线观看| 久久性视频一级片| 亚洲 欧美一区二区三区| kizo精华| 欧美中文综合在线视频| tube8黄色片| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 飞空精品影院首页| 亚洲人成电影观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产欧美亚洲国产| 国产一区二区在线观看av| 秋霞在线观看毛片| 男女边摸边吃奶| 国产精品免费视频内射| 欧美日韩视频精品一区| 国产在线一区二区三区精| 国产成人欧美在线观看 | 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 亚洲国产精品999| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 免费高清在线观看日韩| 黄色视频在线播放观看不卡| 波多野结衣一区麻豆| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲视频免费观看视频| 国产av国产精品国产| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 少妇 在线观看| 美女主播在线视频| 国产精品久久久av美女十八| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久久国产精品麻豆| www日本在线高清视频| 亚洲av国产av综合av卡| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 大码成人一级视频| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲专区国产一区二区| 国产极品粉嫩免费观看在线| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲国产欧美网| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 少妇粗大呻吟视频| 国精品久久久久久国模美| av视频免费观看在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 亚洲av国产av综合av卡| 国产亚洲av高清不卡| 十八禁人妻一区二区| 少妇 在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲人成77777在线视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久国产精品大桥未久av| 高清欧美精品videossex| 精品免费久久久久久久清纯 | 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 水蜜桃什么品种好| 在线看a的网站| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 免费在线观看完整版高清| 国产精品一区二区免费欧美 | 国产麻豆69| 亚洲 国产 在线| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产成人欧美| 在线观看免费午夜福利视频| 久久久久久人人人人人| 99精品久久久久人妻精品| 12—13女人毛片做爰片一| 女警被强在线播放| 久久人人97超碰香蕉20202| 99热国产这里只有精品6| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲 国产 在线| 亚洲伊人久久精品综合| 国产野战对白在线观看| 久久久久视频综合| 男人添女人高潮全过程视频| 午夜久久久在线观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产精品一区二区在线不卡| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 男人爽女人下面视频在线观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产又爽黄色视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲精品在线美女| 欧美一级毛片孕妇| 欧美激情极品国产一区二区三区| 欧美日韩av久久| 午夜老司机福利片| 亚洲视频免费观看视频| 国产亚洲精品一区二区www | 交换朋友夫妻互换小说| 12—13女人毛片做爰片一| 2018国产大陆天天弄谢| 性高湖久久久久久久久免费观看| 久热爱精品视频在线9| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久亚洲国产成人精品v| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲五月婷婷丁香| 国产精品久久久av美女十八| 免费在线观看日本一区| 69av精品久久久久久 | 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲国产精品成人久久小说| 99久久国产精品久久久| 1024香蕉在线观看| 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产真人三级小视频在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久久久久久久免费视频了| 国产成人精品久久二区二区91| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 欧美另类一区| 亚洲九九香蕉| 丝袜在线中文字幕| 欧美中文综合在线视频| 黄色视频,在线免费观看| 另类精品久久| 午夜激情久久久久久久| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产精品一二三区在线看| 国产男人的电影天堂91| 视频区欧美日本亚洲| 欧美成人午夜精品| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 天堂中文最新版在线下载| 久久久久久久大尺度免费视频| 欧美少妇被猛烈插入视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 婷婷成人精品国产| 国产成人啪精品午夜网站| 90打野战视频偷拍视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久久国产一区二区| av有码第一页| www日本在线高清视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 好男人电影高清在线观看| 大码成人一级视频| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲中文日韩欧美视频|