耿美玲 鄭 峰 呂 恒 朱 進(jìn) 胡 丹 郝麗娜 張鳳玉龔秀芳 李丙軍 李先富 潘秀珍 王長軍** 操 敏**
(1.南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所,南京210002;2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,南京210046)
恙蟲病是由恙蟲病東方體Orientiatsutsugamushi引起的蟲媒傳染病和自然疫源性疾病,鼠類為主要傳染源,通過恙螨幼蟲叮咬傳播。恙蟲病東方體的56 kDa蛋白是菌體主要外膜蛋白(Stoveretal.,1990),因其暴露菌體表面、含量豐富以及最常為宿主免疫系統(tǒng)識別等特點(diǎn),因此作為很好的診斷抗原候選者,在ELISA、免疫層析、PCR、qPCR和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)等診斷方法中得到廣泛應(yīng)用(Kimetal.,2011; Blackselletal.,2012);56 kDa蛋白作為型特異性蛋白,對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增、結(jié)合限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析或測序能將東方體分成不同的基因型(郭恒彬等,1997);東方體56 kDa蛋白還被證實(shí)與東方體粘附及侵入宿主細(xì)胞能力密切有關(guān), 在L929細(xì)胞培養(yǎng)過程中加入Boryong 株56 kDa重組抗原免疫的小鼠血清,其吸附和生長分別降低了96 %和91 %(Leeetal.,2008)。此外,56 kDa蛋白還是制備亞單位疫苗的較為理想的候選分子,研究報道Boryong 株56 kDa重組抗原可誘導(dǎo)對同源株的細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng), 保護(hù)小鼠抵抗同源株的再攻擊(Seongetal., 1997a)。攜帶Karp 株東方體56 kDa 抗原基因的DNA疫苗,免疫小鼠獲得部分同源保護(hù)作用(Nietal., 2005)。不同株型東方體56 kDa蛋白存在差異,本研究將含有440個氨基酸的合肥株56 kDa截短蛋白(Qt56)序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹及抗原性分析,同時將其基因在原核系統(tǒng)克隆表達(dá),親和層析法純化目的蛋白,Western-blot及ELISA法鑒定其免疫學(xué)活性,為進(jìn)一步研制廣譜診斷試劑、疫苗以及分析其在東方體致病的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
表達(dá)質(zhì)粒pET28a為Novage公司產(chǎn)品。大腸桿菌E.coliBL21為本實(shí)驗(yàn)室保存。
PCR擴(kuò)增試劑盒、DNA Marker、質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ T4連接酶均為TaKaRa公司產(chǎn)品。DNA 割膠回收試劑盒購自Promega公司, 蛋白Marker為Fermentas公司產(chǎn)品。HRP標(biāo)記的鼠抗人IgG、鄰苯二胺(DAB)顯色液和TMB顯色液購于武漢博士德生物工程有限公司。
在GenBank protein 數(shù)據(jù)庫中,以O(shè).tsutsugamushi為關(guān)鍵詞檢索目的序列。利用Mega 5.0軟件包中的ClustalW對3株國際標(biāo)準(zhǔn)株(Karp、Kato、Gilliam),5株常見株(Kawassaki、Shimokoshi、Kuroki、Yonchon、Boryong), 及國內(nèi)常見株(Hefei、Guangzhou、Shandong、Neimeng、Taiwan、Ptan)的蛋白進(jìn)行序列分析。
使用DNAStar軟件中的Protean,使用DNAstar軟件中的protean對上述中的14條蛋白序列進(jìn)行親水性、溶解性及抗原性分析。
將實(shí)驗(yàn)室前期制備的恙蟲病東方體合肥株56 kDa截短蛋白基因的PCR產(chǎn)物用DNA回收試劑盒回收純化后,用EcoRⅠ 和BamHⅠ雙酶切,回收純化后與同樣經(jīng)雙酶切后回收純化的質(zhì)粒PET28a連接,構(gòu)建帶有HisTag的重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21,涂布含卡那霉素(100 mg/mL)LB平板,置37℃過夜。次日隨機(jī)挑取若干個菌落,分別提取質(zhì)粒,PCR鑒定,陽性者進(jìn)一步同時用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,電泳檢測切出約1 320 bp基因片段的質(zhì)粒判斷為陽性重組質(zhì)粒.
重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliBL21,菌液擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600約為0.6時,100 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)4 h,15%SDS-PAGE 電泳檢測是否有目的蛋白的表達(dá)。將重組體擴(kuò)大培養(yǎng)并經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá),離心收集菌體, PBS 重懸后冰浴超聲破碎菌體,離心后的上清過濾,用Ni2+離子親和層析柱純化蛋白,并進(jìn)行蛋白復(fù)性。
將含有恙蟲病東方體合肥株56 kDa截短蛋白重組質(zhì)粒的重組菌在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),同時設(shè)空質(zhì)粒菌為對照。離心收集菌體, 超聲破碎,將全菌裂解物分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳,采用電轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h;加人抗恙蟲病東方體蛋白的血清(1∶200),37℃孵育1 h;用HRP 標(biāo)記的鼠抗人IgG (1∶4000)37℃孵育1 h;加DAB顯色液顯色。
東方體56 kDa截短蛋白基因工程抗原用包被液分別稀釋為5 μg/mL,每孔包被100 μL于96 孔酶標(biāo)板上,置于4 ℃過夜包被,PBST 洗3次后,用5 %的脫脂奶粉于37 ℃封閉2 h,病人血清分別以1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600稀釋,同時用人的正常血清作對照,37℃孵育1 h, PBST 洗3次,加入100 μL抗人IgG-HRP(1∶4000),37 ℃孵育30 min,用PBST洗凈,甩干,滴加TMB 顯色,約10 min 后滴加 2 mol/L H2SO4終止,于酶標(biāo)儀450 nm 檢測OD 值。以不同濃度(5 000、1 000、500、100、80、60、40 ng/mL)的東方體56 kDa截短蛋白基因工程抗原每孔包被100 μL于包被96 孔酶標(biāo)板,置于4 ℃過夜包被,PBST洗3次后,用5 %的脫脂奶粉于37 ℃封閉2 h,而病人血清以1∶100、1∶200稀釋,同時用人的正常血清作對照,37℃孵育1 h, PBST 洗3次,加入100 μL抗人IgG-HRP(1∶4000),37 ℃孵育30 min,用PBST 洗凈,甩干,滴加TMB 顯色,約10 min 后滴加 2 mol/L H2SO4終止,于酶標(biāo)儀450 nm 檢測OD 值。
利用Megalign及Vector NTI軟件分析,可看出恙蟲病東方體合肥株56 kDa截短蛋白包含有完整蛋白的3個可變區(qū),分別為:VDⅠ(64-92)、VDⅡ(137-157)、VDⅢ(342-357)(圖1)。
經(jīng)DNAStar分析,發(fā)現(xiàn)在合肥株東方體56 kDa截短蛋白氨基酸序列的4個保守區(qū)親水性曲線,抗原性曲線均呈現(xiàn)較高值(圖2)。
圖1 14條Ot56氨基酸序列相似性分析Fig. 1 Similarity analysis of 14 Ot56 amino acid sequences
圖2 Ot56 氨基酸理化特性分析曲線Fig. 2 Physical and chemical characteristic of amino acid Ot 56 sequence
重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增及BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切鑒定,1%瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR產(chǎn)物和酶切片段 約1 320 bp,與目的基因大小相符(圖3)。對陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行序列分析,結(jié)果顯示克隆的靶基因與已測序的該段合肥株東方體56 kDa部分基因序列完全一致。
圖3 重組質(zhì)粒PET28a::tHefei雙酶切鑒定Fig. 3 Identification of the recombinant plasmid PET28a::tHefei digested by double restriction enzymesM: 250 bp DNA Marker;1:重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定;2:重組質(zhì)粒; 3:重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切。M: 250 bp DNA Marker; 1: Identification by PCR; 2: The recombinant plasmid; 3: The plasmid digested by BamHⅠ and EcoRⅠ.
SDS-PAGE 表明,含重組表達(dá)質(zhì)粒的E.coliBL21 經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后在55 kDa左右處有一條明顯的蛋白條帶,分子量大小與預(yù)期一致。利用His 親和層析柱對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步純化,電泳可見一條特異的蛋白條帶,表明得到了較高純度重組蛋白(圖4)。
圖4 SDS-PAGE 檢測蛋白表達(dá)和純化Fig. 4 Expression and purification analysis of recombinant protein SDS-PAGEM:Marker;1: pET28a空質(zhì)粒;2:未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒;3:IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒;4:純化蛋白。M:Protein marker; 1:pET28a/BL21; 2: pET28a::tHefei 56kd /BL21 without IPTG induction; 3:pET28a:: tHefei 56kd/BL21 induced with IPTG;4: Purified recombinant protein.
Western blot 結(jié)果顯示,重組目的蛋白可以與恙蟲病病人血清發(fā)生特異性反應(yīng),在約55 kDa 處出現(xiàn)明顯的條帶(圖5),表明重組蛋白具有特異的免疫反應(yīng)活性。
圖5 Western blot 分析Fig. 5 Analysis of western blotA.正常人血清;B.恙蟲病人血清。M: Marker;1,2: 純化蛋白。A. Negative serum;B. Patient’s positive serum. M:Marker;1,2: Recombinant protein.
以5 μg/mL合肥株東方體重組抗原濃度包被,稀釋度為1∶12 800病人血清仍可以檢出陽性(圖6),合肥株東方體重組抗原濃度最低為80 ng/mL時仍可有效區(qū)分陰陽性血清(圖7),表明目的蛋白有較強(qiáng)免疫活性。陽性判定標(biāo)準(zhǔn):P/N值(陽性孔OD值/陰性孔OD值)大于或等于2.1為陽性。
圖6 不同濃度恙蟲病人血清的抗體效價Fig 6 The titer of different concentrations of patients ‘serum
圖7 不同抗原濃度的抗體效價Fig.7 The titer of different concentration of antigenHefei A:恙蟲病人血清濃度1∶100;Control A:正常人血清濃度1∶100;Hefei B: 恙蟲病人血清濃度1∶200;Control B: 正常人血清濃度1∶200。Hefei A:Patients’serum concentration 1∶100;Control A:Negative serum concentration 1∶100;Hefei B:Patients’serum concentration 1∶200; Control B:Negative serum concentration 1∶200.
恙蟲病東方體56 kDa蛋白在東方體的分型、診斷、疫苗研制及致病分子機(jī)制研究中均有重要作用(左小華等,2010)。根據(jù)針對56 kDa蛋白的分子生物學(xué)分型方法,在世界范圍內(nèi)至少已報道有超過30種抗原型別不同的東方體。本課題組前期已對合肥株56 kDa蛋白的基因進(jìn)行過分析(操敏等,2013),本研究對該部分56 kDa蛋白經(jīng)DNAStar分析,發(fā)現(xiàn)在VDⅠ(64-92)、VDⅡ(137-157)、VDⅢ(342-357)為變異區(qū),其余為保守區(qū),與Ohashi 等(1992)等對Kato、Kawasiki、Shimokoshi、Gilliam、Karp 和Kuorki 6 條不同血清型的Ot 56 序列分析結(jié)果類似,與劉昌政(2008)等分析的氨基酸的5個高可變區(qū)和6個高保守區(qū)也相符。早在1997年Seong等(1997b)就發(fā)現(xiàn)Boryong株氨基酸的19~113、142~203、和243~328 等3個區(qū)域具有強(qiáng)的抗原反應(yīng)性,而接著Choi等(1999)又發(fā)現(xiàn)該序列的393~432區(qū)域也具有抗原反應(yīng)性。本研究發(fā)現(xiàn)56 kDa截短蛋白氨基酸序列的4個保守區(qū)ADⅠ(1-64)、 ADⅡ(93-136)、ADⅢ(158-341)、ADⅣ(358-440)處親水性線,抗原性曲線均呈現(xiàn)較高值,提示其可作為診斷、疫苗等設(shè)計的靶點(diǎn)。合肥株截短56 kDa蛋白基因包含3個可變區(qū)和大部分穩(wěn)定區(qū)長約1 350 bp基因序列,含與同型和異型抗體反應(yīng)的抗原表位區(qū)域,將其與表達(dá)載體PET28a 6個組氨酸尾融合表達(dá),得到了穩(wěn)定表達(dá)。SDS-PAGE電泳證明誘導(dǎo)后的蛋白表達(dá)顯著,產(chǎn)物經(jīng)鎳(Ni2+)柱親和層析純化后復(fù)性得到目的蛋白。免疫印跡和ELISA結(jié)果證實(shí),純化蛋白能被患者血清所識別,與健康正常人血清不起作用,表明其能夠有效區(qū)分恙蟲病陽性和陰性血清,稀釋到 80 ng/mL的合肥重組抗原仍可檢測陽性血清,具有良好的抗原性,可作為重組抗原取代天然抗原作為診斷抗原,達(dá)到經(jīng)濟(jì)、特異和安全的目的。
本課題組近年來研制了以東方體平潭株和Gilliam株基因工程抗原混合為診斷抗原的恙蟲病膠體金快速診斷試劑(Caoetal.,2007),適用于基層部隊(duì)及疫區(qū)現(xiàn)場快速檢測。但有研究報道東方體抗原對同型抗體能起較強(qiáng)反應(yīng),而對異型抗體反應(yīng)微弱甚至不起反應(yīng)(Ohashietal.,1988; Choietal.,1999;Kimetal., 2013)。因此,將不同東方體型別抗原混合作為診斷抗原,可能將有利于進(jìn)一步提高該試劑的敏感性,擴(kuò)大其檢測譜。本研究獲得的重組抗原,有望與其他型別56 kDa蛋白混合作為重組抗原制備廣譜的恙蟲病膠體金快速診斷試劑盒,或單獨(dú)作為診斷抗原,制備具有地域特點(diǎn)的診斷試劑。同時,還可進(jìn)一步用于恙蟲病的疫苗制備,分子致病機(jī)制的等研究。