rDNA-ITS2序列作為中國按蚊分子鑒別特征的評述：Ⅱ塞蚊亞屬*

伍 桐 諸德源 王一然 馬雅軍

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生學(xué)系熱帶傳染病教研室，上海 200433；2.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅學(xué)員一隊(duì)，上海 200433)

關(guān)于rDNA-ITS2序列作為中國按蚊分子鑒別特征的評述，筆者分為兩個(gè)部分(按蚊亞屬和塞蚊亞屬)進(jìn)行，本文評述的是第Ⅱ部分，即塞蚊亞屬蚊種。塞蚊亞屬(SubgenusCellia)隸屬于雙翅目(Diptera)，蚊科(Culicidae)，按蚊亞科(Anophelinae)，按蚊屬Anopheles，中國已記錄30余種(陸寶麟，1997； Harbach，2007；2012)。

1 材料與方法

1.1 rDNA-ITS2序列信息

在GenBank數(shù)據(jù)庫中，以中國塞蚊亞屬蚊種名為關(guān)鍵詞(陸寶麟等，1997)，搜索獲得其所有注冊登記的ITS2序列，進(jìn)行整理。

1.2 序列分析方法

將下載的所有序列，首先采用Clustal X軟件包進(jìn)行對齊和比對分析，之后轉(zhuǎn)化為MEGA5可識別文件，計(jì)算序列間的差異性(p-distance)。

2 結(jié)果

2.1 ITS2序列信息

截至2013年7月，GenBank中公布的中國塞蚊亞屬蚊種的ITS2序列共442條，隸屬27種(表1)。

2.2 ITS2序列在種內(nèi)的差異

2.2.1庫態(tài)按蚊: 已注冊ITS2序列的庫態(tài)按蚊樣本來自印度、伊朗、柬埔寨和中國，其樣本信息或描述為A、B、C、D和E種，或未描述，各種是依據(jù)唾腺多線染色體和雄蚊的染色體核型確定(Singhetal.,2004)，共33條。比對所有的序列，EF192274與其他序列間差異性大于10%；庫態(tài)按蚊A與D種間序列差異性小于0.3%，無種信息的AY427755、JF966734和JF966735應(yīng)為A/D；庫態(tài)按蚊B、C與E種間差異小于1%，AY427754應(yīng)為B/C/E，筆者注冊的我國庫態(tài)按蚊樣本應(yīng)為B種(馬雅軍等，2011)；A/D與B/C/E之間的差異范圍為4.9%～6.2%。

表1 中國塞蚊亞屬蚊種在GenBank中的rDNA-ITS2序列信息(截至2013年7月)Tab.1 Nucleotide sequences of the rDNA-ITS2 of Chinese Subgenus Cellia mosquitoes in the GenBank (by July 2013)

續(xù)表1
Tabl.1Continued

種類Species測序樣本信息Sequence featureGenBank登記號Accession number文獻(xiàn)References達(dá)羅毗按蚊An.dravidicus泰國Thailand Form KDQ518624Walton et al., 2007老撾LaosDQ002906直接提交Direct submission中國ChinaAF261951Ma et al., 2006; 馬雅軍等, 2011印度IndiaJQ446414-16Singh et al., 2012泰國ThailandFJ526587-88Morgan et al., 2009溪流按蚊An.fluviatilis伊朗IranDQ662405/AF440788/AY049001直接提交Direct submission伊朗IranAY172564-67Naddaf et al., 2003伊朗IranDQ238491Chen et al., 2006—AY427767直接提交Direct submission伊朗Iran Type SDQ344524直接提交Direct submission印度India Type SDQ345964Singh et al., 2006伊朗Iran Type UGQ926569-89/DQ344525直接提交Direct submission伊朗Iran Type UDQ238492Chen et al., 2006伊朗Iran Type VDQ344526/AF333384直接提交Direct submission伊朗Iran Type TDQ427095直接提交Direct submission伊朗Iran Haplotype TGQ857439-49Mehravaran et al., 2011伊朗Iran Type T1GQ926590-91直接提交Direct submission伊朗Iran Type T1DQ238490Chen et al., 2006伊朗Iran Type T2AF440788/AY049001/AY049005直接提交Direct submission印度India Type XAF167298Manonmani et al., 2001印度India Type YAF167299/AF509342Manonmani et al., 2001伊朗Iran Type YAF509343-53/AY172564-66Naddsf et al., 2003伊朗Iran Type YAY172567/AY049003/AY365048/AY365051直接提交Direct submission哈里森按蚊An.harrisoni2泰國ThailandAF194506Sharpe et al., 2000緬甸MyanmarDQ665847Singh et al., 2006越南VietnamAY255109Garros et al., 2005—AF230462Van Bortel et al., 2000中國ChinaAF416784周水森等, 2002中國ChinaDQ238493Chen et al., 2006中國ChinaAY007167Ma et al., 2005; 馬雅軍等, 2011無定按蚊An. indefinitus菲律賓PhilippinesGQ870332直接提交Direct submission詹氏按蚊An.jamesii印度IndiaJN710012Zomuanpuii et al., 2013斯里蘭卡Sri LankaFJ526628-29Morgan et al., 2009緬甸MyanmarFJ526630Morgan et al., 2009泰國ThailandFJ526631Morgan et al., 2009杰普爾按蚊An.jeyporiensis印度IndiaJN643728Zomuanpuii et al., 2013—AF230466Van Bortel et al., 2000卡瓦爾按蚊An. karwari斯里蘭卡Sri LankaFJ526635Morgan et al., 2009腹簇按蚊An.kochi中國ChinaEU650424馬雅軍等, 2011多斑按蚊An.maculatus印度IndiaJQ446428-38Singh et al., 2012印度IndiaJN710013Zomuanpuii et al., 2013—EF192272直接提交Direct submission泰國Thailand Form KDQ518615Walton et al., 2007越南Vietnam Form KDQ518617Walton et al., 2007柬埔寨Cambodia Form KDQ518618Walton et al., 2007馬來西亞Malaysia Form KDQ518619Walton et al., 2007中國China Form KDQ518616Walton et al., 2007越南VietnamAY803346-52直接提交Direct submission

續(xù)表1
Tab.1Continued

種類Species測序樣本信息Sequence featureGenBank登記號Accession number文獻(xiàn)References—AF440197直接提交Direct submission中國ChinaAF261950Ma et al., 2006; 馬雅軍等, 2011緬甸MyanmarFJ526577-78Morgan et al., 2009斯里蘭卡Sri LankaFJ526579Morgan et al., 2009柬埔寨CambodiaFJ526580-81Morgan et al., 2009泰國ThailandFJ526582-83Morgan et al., 2009老撾LaosFJ526584Morgan et al., 2009東帝汶East TimorGQ500120Cooper et al., 2010馬來西亞MalaysiaAY491974直接提交Direct submission微小按蚊An.minimus3泰國ThailandAF194495-504Sharpe et al., 2000中國ChinaAY007169-71Ma et al., 2005; 馬雅軍等, 2011柬埔寨CambodiaAY737081Ma et al., 2005; 馬雅軍等, 2011中國ChinaAF416783周水森等, 2002—AF230461Van Bortel et al., 2000—AY255108Garros et al., 2004印度IndiaDQ336436Prakash et al., 2006中國China/泰國Thailand/越南Viet-namDQ238494Chen et al., 2006中國ChinaFN646403直接提交Direct submission印度IndiaJQ845943Zomuanpuii et al., 2013雪足按蚊An.nivipes印度IndiaJN654424-32Sarma et al., 2012印度IndiaJN643727Zomuanpuii et al., 2013印度IndiaDQ279434-42Alam et al., 2007a印度IndiaDQ013796Alam et al., 2007a中國ChinaEU919722/EU650426馬雅軍等, 2011印度IndiaDQ013800/DQ336434/FJ159607直接提交Direct submission中國China FJ526621Morgan et al., 2009泰國ThailandFJ526622-23Morgan et al., 2009緬甸MyanmarFJ526624Morgan et al., 2009帕氏按蚊An. pattoni中國ChinaEU919719馬雅軍等, 2011菲律賓按蚊An.philippinensis印度IndiaJN643725Zomuanpuii et al., 2013印度IndiaDQ407724/JN654433-38/DQ319187/DQ159606直接提交Direct submission中國ChinaGU373719馬雅軍等, 2011印度IndiaFJ526616-17Morgan et al., 2009老撾LaosFJ526618Morgan et al., 2009泰國ThailandFJ526619Morgan et al., 2009柬埔寨CambodiaFJ526620Morgan et al., 2009偽威氏按蚊An.pseudowillmo-ri泰國ThailandDQ518628Walton et al., 2007越南VietnamDQ518629Walton et al., 2007中國ChinaAF512550/AF261952Ma et al., 2006; 馬雅軍等, 2011印度IndiaJQ446421-27Singh et al., 2012泰國ThailandFJ526572Morgan et al., 2009印度IndiaFJ526573-74Morgan et al., 2009緬甸MyanmarFJ526575Morgan et al., 2009老撾LaosFJ526576Morgan et al., 2009塞沃按蚊An.sawadwongporni泰國ThailandDQ518620Walton et al., 2007中國ChinaDQ518621Walton et al., 2007越南VietnamDQ518622Walton et al., 2007柬埔寨CambodiaDQ518623Walton et al., 2007

續(xù)表1
Tab.1Continued

種類Species測序樣本信息Sequence featureGenBank登記號Accession number文獻(xiàn)References越南VietnamAY803342-44直接提交Direct submission柬埔寨CambodiaAY803345直接提交Direct submission中國ChinaAF512551Ma et al., 2005, 2006; 馬雅軍等, 2011印度IndiaJQ446417-20Singh et al., 2012越南VietnamFJ526589Morgan et al., 2009柬埔寨CambodiaFJ526590Morgan et al., 2009印度IndiaFJ526591Morgan et al., 2009泰國ThailandFJ526592-93Morgan et al., 2009美彩按蚊An.splendidus—EF192276直接提交Direct submission印度IndiaEU366356直接提交Direct submission中國ChinaEU650427/EU919721馬雅軍等, 2011柬埔寨CambodiaFJ526600-01Morgan et al., 2009越南VietnamFJ526602Morgan et al., 2009泰國ThailandFJ526603-05Morgan et al., 2009斯氏按蚊An.stephensi—HQ703001/EF192275直接提交Direct submission印度IndiaEU359661-81Alam et al., 2008伊拉克IraqEU346652-53直接提交Direct submission伊朗IranDQ662409/DQ662406-07/AY365049/AY365050/AY157316/AY157678直接提交Direct submission伊朗IranAY702490/AY702482-6Djadid et al., 2006實(shí)驗(yàn)室品系Lab colonyFJ011430/FJ154840馬雅軍等, 2011—FJ526599 Morgan et al., 2009淺色按蚊An.subpictus—HQ703002/EF192277直接提交Direct submission越南VietnamGQ870325/GQ870330/AB731656直接提交Direct submission柬埔寨CambodiaGQ870326/GQ870329直接提交Direct submission印度尼西亞IndonesiaGQ870327/GQ870328/GQ870335直接提交Direct submission泰國ThailandGQ870333直接提交Direct submission緬甸MyanmarGQ870334直接提交Direct submission斯里蘭卡Sri LankaGQ870336/GQ870337/AY049004/AF406613-16直接提交Direct submission印度IndiaEF601868-70/JQ845942直接提交Direct submission東帝汶East TimorGQ480827-28直接提交Direct submission棋斑按蚊An.tessellatus中國ChinaEU650425馬雅軍等, 2011迷走按蚊An.vagus印度IndiaJN710015/JN6437286Zomuanpuii et al., 2013印度尼西亞IndonesiaFJ654648-49Zarowiecki et al., 2011柬埔寨CambodiaAY737080Ma et al., 2005; 馬雅軍等, 2011中國ChinaEU919718/FJ457631馬雅軍等, 2011印度IndiaHQ873039直接提交Direct submission越南VietnamAB731658Kuwata et al., 2013東帝汶East TimorGQ500122/GQ480823-24直接提交Direct submission瓦容按蚊An.varuna印度IndiaJN643726/DQ478879/HQ873035-37直接提交Direct submission—AY255111Garros et al., 2004泰國ThailandAF194489-90Sharpe et al., 2000—AF230465Van Bortel et al., 2000威氏按蚊An.willmori中國ChinaAF512552Ma et al., 2006; 馬雅軍等, 2011印度IndiaJQ446411-12Singh et al., 2012不丹BhutanEU882061Somboon et al., 2008

—無測序樣本信息,no information of sequenced sample。
1同物異名大劣按蚊A,synonym ofAn.dirusA;2同物異名微小按蚊C,synonym ofAn.minimusC;3同物異名微小按蚊A,synonym ofAn.minimusA。

2.2.2大劣按蚊: 已注冊ITS2序列的大劣按蚊(廣義)樣本來自中國和泰國，共8條，樣本信息描述為大劣按蚊和大劣按蚊D，此兩型為據(jù)染色體核型不同而確定(Baimaietal.,1987；1988)。筆者比對了大劣按蚊D的5條ITS2序列(DQ629910-DQ629914)，結(jié)果顯示其間差異性小于1.0%，其余序列因長度差異大，無法進(jìn)行比對。

Walton等(1999)報(bào)道了泰國大劣按蚊復(fù)合體5種的ITS2序列(該文的所有序列未在GenBank中注冊)，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)泰國的大劣按蚊(原文大劣按蚊A)與我國海南標(biāo)本(ADU60410)的序列完全一致；但白麥按蚊An.baimaii(Sallumetal.,2005)(原文大劣按蚊D)與我國云南的標(biāo)本(ADU60411)相比，其序列在長度和堿基組成上均存在較大差異(泰國標(biāo)本479 bp)。Walton的測序標(biāo)本來自泰國白麥按蚊的模式產(chǎn)地，并經(jīng)染色體鑒別確認(rèn)，可靠性強(qiáng)；而我國大劣按蚊D的測序標(biāo)本采自為云南勐臘，該采集地的大劣按蚊(廣義)染色體核型被Baimai通過照片確定為大劣按蚊D(Xuetal.,1991)，而測序標(biāo)本并未經(jīng)染色體核型確認(rèn)，則目前仍以大劣按蚊D表示，而與白麥按蚊的關(guān)系需進(jìn)一步探討。

2.2.3溪流按蚊: 已注冊溪流按蚊ITS2序列共73條，樣本來自印度和伊朗，尚無中國的樣本，大多數(shù)測序樣本信息描述為型S/T/U型或T1/T2/V/X/Y型。S/T/U型是依據(jù)溪流按蚊唾腺多線染色體2號臂上的固定倒位命名(Subbaraoetal.,1994)，T1/T2/V/X/Y型是依據(jù)ITS2序列特征命名(Naddafetal.,2002,2003; Manonmanietal.,2003；Chenetal.,2006)。筆者比對了所有的溪流按蚊序列，發(fā)現(xiàn)AF509348～53/AY172565與其他序列間差異性大于50%，查看后發(fā)現(xiàn)是因注冊的序列是反向鏈導(dǎo)致；其余的溪流按蚊ITS2序列間差異最大為4.50%，差異程度無論與染色體型還是分子型均較難對應(yīng)。

有學(xué)者將溪流按蚊的染色體型與分子型對應(yīng)分析，顯示94%的X型和90%的Y型分別與S型和T型相同(Manonmanietal.,2003)，也有報(bào)告顯示100%的Y型與T型相同(Naddafetal.,2002,2003)。溪流按蚊T型又包括3個(gè)單倍型(T1,T2和Y)；U型與T型非常近似，推測是分布在局部地區(qū)的雜交種；ITS2序列的差異性提示尚存在分布于伊朗的V型和印度的X型(Chenetal.,2006)。Garros等(2005)依據(jù)D3序列特征指出，東南亞的溪流按蚊S型即哈里森按蚊，為同物異名。Chen等(2006)進(jìn)一步指出印度的溪流按蚊S型與東南亞的哈里森按蚊為同種。之后，分別分析了溪流按蚊S型與哈里森按蚊的ITS2和核糖體DNA 28S編碼區(qū)第2和3結(jié)構(gòu)域(Ribosomal DNA 28S coding region,the second and the third domain D2-D3)序列，發(fā)現(xiàn)兩者存在的差異，提出仍是獨(dú)立種；同時(shí)認(rèn)為溪流按蚊S型與X型為同物異名(Singhetal.,2006)；印度的溪流按蚊U型也為微小按蚊(Singhetal.,2010)等。由此可見，溪流按蚊的分類非常復(fù)雜，目前尚未達(dá)成共識，其隱種在我國的分類地位需進(jìn)一步探討。

2.2.4微小按蚊和哈里森按蚊: 微小按蚊的ITS2序列來源樣本包括泰國、中國、印度、柬埔寨和越南，共21條；哈里森按蚊是據(jù)原微小按蚊染色體C型命名(Harbachetal.,2007)，已注冊ITS2序列的樣本來自泰國、緬甸、越南和中國，共7條。將兩種的ITS2序列分別進(jìn)行對齊和比對，顯示微小按蚊與哈里森按蚊的種內(nèi)差異均小于1%。

微小按蚊(廣義)是包括多個(gè)成員種的復(fù)合體，依據(jù)ITS2特征，確定在我國分布微小按蚊和哈里森按蚊(周水森等，2002)。曾有根據(jù)海南省微小按蚊的形態(tài)和生態(tài)習(xí)性的變異定名的微小按蚊B(Yu,1987)，Chen等(2002)依據(jù)D3部分序列分析，認(rèn)為應(yīng)是微小按蚊的形態(tài)學(xué)變異；也有文獻(xiàn)報(bào)道香港存在與微小按蚊近緣的分子型等(Harbachetal.,2006)?？梢?，微小按蚊復(fù)合體在我國相當(dāng)復(fù)雜，仍需進(jìn)一步探討。

2.2.5多斑按蚊復(fù)合體: 目前已知多斑按蚊復(fù)合體包括有9種(Harbach,2012)，在我國分布的有5種(Maetal.,2006)，ITS2序列均有注冊，即達(dá)羅毗按蚊(注冊序列條數(shù)為8)、多斑按蚊(37)、偽威氏按蚊(16)、塞沃按蚊(18)和威氏按蚊(4)。筆者比對了各種內(nèi)的序列，顯示除多斑按蚊外，差異性均小于1%；多斑按蚊注冊的序列較多，其中AF440197與其他序列的差異性大于50%，查看后發(fā)現(xiàn)也是因序列為反向鏈導(dǎo)致；EF192272與其他序列的差異性大于5%，BLAST搜索顯示與斯氏按蚊的ITS2序列最為相似(97%)，猜測是樣本鑒定錯誤；其余的ITS2序列間差異性小于1%。另外，多斑按蚊的5條序列(DQ518615-DQ518619)注冊信息中顯示，為K型，多斑按蚊K型目前已定名為Anophelesrampae(Somboonetal.,2011)，但上述序列BLAST搜索顯示仍為多斑按蚊，故需更新樣本信息。

2.2.6環(huán)紋按蚊復(fù)合體: 目前已知環(huán)紋按蚊復(fù)合體包括4種(Harbach,2012)，在我國分布的有3種，即環(huán)紋按蚊(30)、雪足按蚊(29)和菲律賓按蚊(16)(陸寶麟等，1987)，其ITS2序列均有注冊。GenBank中注冊ITS2序列的環(huán)紋按蚊樣本信息描述中有種A和B，為依據(jù)卵巢的多線染色體的條帶確定(Atrieetal.,1999)，序列比對結(jié)果顯示，種A與B的ITS2序列差異大小在種內(nèi)和種間存在重疊，均小于3%。雪足按蚊與菲律賓按蚊的形態(tài)非常近似，尤其是雌蚊和幼蟲期難以辨別，兩蚊種注冊的ITS2序列在種內(nèi)的差異均小于1%。

2.2.7其他按蚊: 筆者比對了31條注冊的烏頭按蚊ITS2序列，發(fā)現(xiàn)采自中國的EU650423與其他的差異范圍為6.7%～8.5%，提示該種的序列需進(jìn)一步核對。在41條斯氏按蚊ITS2序列中，除HQ703001和 EF192275外，其余序列間差異小于1%。

注冊的淺色按蚊25條序列較為復(fù)雜，比對后發(fā)現(xiàn)EF192277和HQ192277與其他序列的差異大于50%，其余23條序列間的差異范圍為0%～25.2%，測序樣本來自越南、柬埔寨、緬甸、斯里蘭卡、東帝汶、泰國、印度尼西亞和印度等8個(gè)國家，差異大應(yīng)是淺色按蚊的形態(tài)學(xué)鑒別混亂導(dǎo)致。迷走按蚊的成蚊形態(tài)變異較大，準(zhǔn)確鑒別也較為困難，且發(fā)現(xiàn)ITS2序列的多個(gè)位點(diǎn)在種內(nèi)存在套峰(朱釗民等，2011)，故差異最大可達(dá)3.2%。

除上述和僅注冊1條序列的蚊種外，其余的已注冊的ITS2序列的塞蚊亞屬種內(nèi)差異性均小于1.0%。

2.3 ITS2序列在種間的差異

筆者選取在GenBank中注冊的中國塞蚊亞屬種類的其中1條ITS2序列作為蚊種的代表，進(jìn)行種間序列差異分析，此處忽略了種內(nèi)差異較大的溪流按蚊、烏頭按蚊和淺色按蚊，結(jié)果顯示差異范圍為2.8%(大劣按蚊與大劣按蚊D)～68.3%(多斑按蚊與迷走按蚊)(表2)，與按蚊亞屬蚊種間的差異性范圍相似。

3 討論

筆者在整理GenBank數(shù)據(jù)庫中已注冊的中國塞蚊亞屬蚊種的ITS2序列時(shí)，發(fā)現(xiàn)僅有少數(shù)分布局限的尚無序列注冊；與按蚊亞屬相同的是，在已注冊的序列中，由采自中國的樣本測定的序列數(shù)量仍較少。通過分析已注冊的ITS2序列，提示對于中國的塞蚊亞屬大多數(shù)蚊種具有良好的解析度。

同時(shí)，筆者也發(fā)現(xiàn)ITS2序列在部分種內(nèi)存在較大的差異性。分析其原因，其一，有些蚊種的進(jìn)化快速且活躍，隱種近期或正在分化，已報(bào)告有的存在不同的染色體核型，如：溪流按蚊、庫態(tài)按蚊、環(huán)紋按蚊和大劣按蚊等，其種內(nèi)個(gè)體的差異體現(xiàn)在ITS2序列存在套峰，且序列的差異程度與染色體核型無法對應(yīng)；其二，某些種類的成蚊形態(tài)變異較大，鑒別錯誤或混淆難以避免(大多為Sharma與Kaura提交的序列)，如：淺色按蚊、烏頭按蚊、溪流按蚊、雪足按蚊和菲律賓按蚊等，其種內(nèi)的差異較大，以至于難以確定種的特異序列。有鑒于此，塞蚊亞屬部分蚊種目前尚難以依據(jù)注冊的ITS2序列鑒別，其他分子標(biāo)志應(yīng)更為敏感和可靠(吳靜等，2010)。

迄今，在學(xué)者報(bào)告新物種時(shí)，分子特征的佐證愈來愈重要，且從客觀的分子特征發(fā)現(xiàn)新的類型，然后描述其形態(tài)特征，再命名新種，通常采用的是此技術(shù)路線，如：塞蚊亞屬中的哈里森按蚊、An.rampae和白麥按蚊等。