基于IFA技術(shù)檢測微線體蛋白2在艾美耳屬球蟲的空間分布*

田秀玲 湯新明 秦 梅 索靜霞 劉賢勇 索 勛

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

艾美耳屬球蟲是一類廣泛寄生于多種宿主動物消化系統(tǒng)的頂復(fù)門原蟲。艾美耳屬球蟲生活史復(fù)雜，包括在宿主體內(nèi)的無性生殖(裂殖生殖)和有性生殖(配子生殖)兩個階段(索勛等, 1998)。無論是裂殖生殖還是配子生殖時，都需要子孢子或裂殖子分泌棒狀體蛋白和微線體蛋白來協(xié)助入侵(Dubremetzetal., 1998)。其中，微線體蛋白2是柔嫩艾美耳球蟲入侵宿主細(xì)胞時分泌的主要蛋白之一，亦是構(gòu)成微線體細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)蛋白(Tomleyetal., 1996)。但是，現(xiàn)有文獻(xiàn)資料并不能清晰的闡明球蟲微線體蛋白2與宿主細(xì)胞相互作用的機(jī)制。主要因?yàn)槟壳八\(yùn)用的靜態(tài)觀察(如電鏡)的辦法還難以記錄分泌、侵入等動態(tài)過程(索勛等, 1998)。以上所述是基于雞球蟲的研究，關(guān)于其他物種的艾美耳屬球蟲微線體蛋白2的研究只有極少的相關(guān)報道和文獻(xiàn)資料(Watanabeetal., 2001)。

間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(Indirect Immunofluorescence Assay, IFA)技術(shù)是基于免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)等學(xué)科的發(fā)展建立的一種檢測技術(shù)。由于其特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快、可視效果佳等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等生命科學(xué)研究領(lǐng)域(Sardyetal., 2013)。間接免疫熒光染色技術(shù)亦是原生動物生物學(xué)、免疫學(xué)等研究最為常見的技術(shù)之一，如研究瘧原蟲、弓形蟲及艾美耳屬球蟲蛋白的空間定位、寄生蟲與宿主細(xì)胞的蛋白互作、免疫及其他信號通路等(Tschanetal., 2010; Huangetal., 2011; Sunetal., 2012)。

本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了一株柔嫩艾美耳球蟲微線體蛋白2(EtMic2)單克隆抗體，在前期研究中，以該株單克隆抗體檢測柔嫩艾美耳球蟲表達(dá)分泌型外源蛋白的空間定位，發(fā)現(xiàn)該株單克隆抗體應(yīng)用于間接免疫熒光染色技術(shù)檢測效果良好(Huangetal., 2011)。鑒于其他物種艾美耳屬球蟲微線體蛋白2研究的匱乏，本研究利用柔嫩艾美耳球蟲微線體蛋白2(EtMic2)單克隆抗體為檢測抗體，利用間接免疫熒光染色技術(shù)檢測微線體蛋白2在其他艾美耳屬球蟲的空間分布，初步確定微線體蛋白2在艾美耳屬球蟲空間分布的共性與特性，為微線體蛋白2的后續(xù)研究及研究艾美耳屬球蟲相關(guān)蛋白的分布奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與蟲株

柔嫩艾美耳球蟲Eimeriatenella北京株，和緩艾美耳球蟲E.mitis涿州株，斯氏艾美耳球蟲E.stiedai張家口株，無殘艾美耳球蟲E.irresidua張家口株均由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1日齡AA肉雞購自北京華都肉雞有限公司，飼養(yǎng)于無球蟲污染的禽用隔離器(IPQ-3型，蘇州市蘇杭實(shí)驗(yàn)動物設(shè)備廠)中，自由采食、飲水。

實(shí)驗(yàn)用新西蘭大白兔由本實(shí)驗(yàn)室涿州實(shí)驗(yàn)基地提供。

1.2 卵囊富集

E.tenella與E.mitis卵囊的富集使用4只2～3周齡AA肉雞(體重約0.5 kg，雌雄各半)，E.stiedai與E.irresidua卵囊的富集使用2只6周齡新西蘭大白兔(體重約為1 000 g，雌雄各半)?？诜臃N適量卵囊后，飽和鹽水漂浮法收集排卵囊期糞便中的卵囊(肝臟中的E.stiedai卵囊用胰酶消化法收集)，重懸于2.5%的重鉻酸鉀溶液中，26℃，48 h孢子化后，4℃保存，備用。

1.3 子孢子提取

本研究用子孢子的提取依據(jù)參考文獻(xiàn)(Liuetal., 2008)。取1×107純化后的孢子化卵囊，冰浴研磨，鏡檢至80%以上卵囊破碎釋放出孢子囊。用脫囊消化液(10%膽汁+ 90 % PBS + 0.75%胰酶)42℃消化30 min左右，至90%以上子孢子從孢子囊釋放，洗去脫囊消化液，加入預(yù)先平衡好的DE-52纖維素層析柱中進(jìn)行子孢子的純化，洗脫液為甘氨酸緩沖液(pH=8.0)，以恒流泵控制流速為1～2滴/s，每2 min鏡檢流出液體中子孢子含量及純度，待視野中子孢子量極少或出現(xiàn)孢子囊時，停止過柱，純化完畢(整個純化過程維持環(huán)境溫度在42℃左右)。純化后血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)后子孢子濃度稀釋至每100 μL含有106個子孢子，備用。

1.4 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFA)

IFA操作步驟依據(jù)參考文獻(xiàn)(Huangetal., 2011)。載玻片以多聚賴氨酸預(yù)處理，滴加100 μL子孢子懸液，待其自然沉降后，-20℃甲醇固定10 min；穿膜緩沖液(Triton X-100)室溫孵育5 min；1% BSA封閉30 min；EtMic2單抗(本實(shí)驗(yàn)室制備)稀釋后(確定最佳稀釋度時作1∶100、1∶200、1∶500、1∶800和1∶1 000五個稀釋度，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用1∶100稀釋)室溫孵育1 h，同時以無關(guān)抗體(鼠抗黃色熒光蛋白，本實(shí)驗(yàn)室制備)作為對照；Cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Proteintech Group, Inc)1∶100稀釋室溫孵育1 h(上述各操作均需PBS(pH=7.4)洗滌5次)；滴加抗熒光衰減劑后封片，4℃避光保存，待鏡檢。鏡檢時，使用激光共聚焦顯微鏡(萊卡，Leica TCSSP5Ⅱ)觀察，并保存圖像。

1.5 圖像處理

本實(shí)驗(yàn)所有圖像均采用LAS AF Lite(萊卡，Leica)軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 EtMic2單克隆抗體可應(yīng)用于間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFA)

利用單克隆抗體制備技術(shù)，我們獲得了若干株抗EtMic2的單克隆抗體，并對其進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)其中一株(2A52D61G8)應(yīng)用于IFA可特異性的與柔嫩艾美耳球蟲子孢子Mic 2蛋白特異性結(jié)合(圖1-1)。說明該株單克隆抗體能夠特異性識別Mic 2的抗原表位，應(yīng)用于間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)。

抗體稀釋濃度是影響IFA結(jié)果的關(guān)鍵因素之一，本實(shí)驗(yàn)所用熒光標(biāo)記的二抗為商品化試劑，選擇推薦使用濃度(1∶100)，為保證實(shí)驗(yàn)的特異性與敏感性，我們分別以1∶100、1∶200、1∶500、1∶800和1∶1 000五個一抗(EtMic2單抗)濃度梯度進(jìn)行比較，以確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用抗體的最佳稀釋濃度。結(jié)果顯示，一抗稀釋比例為1∶100時所有蟲體(柔嫩艾美耳球蟲子孢子)能夠在微線體部位檢測出特異性熒光(圖1)，并且沒有非特異背景著色；稀釋比例為1∶1 000時所有蟲體均檢測不到特異性熒光；其余3個稀釋比例下，亦有部分蟲體不能著色(結(jié)果未顯示)，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)一抗稀釋比均選擇1∶100。

圖1 EtMic2定位于柔嫩艾美耳球蟲、和緩艾美耳球蟲、斯氏艾美耳球蟲、無殘艾美耳球蟲子孢子頂部Fig. 1 Mic 2 protein was located in the anterior region of E. tenella, E. mitis, E. stiedai, E. irresidua sporozoitesA：以EtMic 2單抗為一抗，Cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗；B: 以無關(guān)抗體為一抗，Cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗。Cy3：紅色熒光通道采集的圖像；Bright：白光通道采集的圖像；Merge：上述兩圖像的組合。1. 柔嫩艾美耳球蟲; 2. 和緩艾美耳球蟲; 3. 斯氏艾美耳球蟲; 4. 無殘艾美耳球蟲。標(biāo)尺=5 μm。A: The primary antibody was EtMic 2 monoclonal antibody and the secondary antibody was Cy3-Goat-anti-Mouse IgG; B: The primary antibody was a negative antibody and the secondary antibody was Cy3-Goat-anti-Mouse IgG. Cy3: Image was captured from RFP light laser; Bright: Image was captured from white light laser; Merge: Image obtained from the above two images. 1. E. tenella；2. E. mitis；3. E. stiedai；4. E. irresidua. Bar=5 μm.

2.2 EtMic 2蛋白在艾美耳屬球蟲子孢子的空間分布

柔嫩艾美耳球蟲E.tenella作為雞球蟲研究的模式蟲種，某些蛋白(如Mic2)的空間定位、與宿主細(xì)胞互作等均有報道(Dingetal., 2005)，本研究擬確定針對EtMic2的單克隆抗體能否識別其他艾美耳屬球蟲的微線體蛋白2，初步確定Mic 2的空間分布。結(jié)果顯示，無論是寄生于雞其他種的艾美耳屬球蟲如和緩艾美耳球蟲E.mitis還是寄生于兔的艾美耳屬球蟲如斯氏艾美耳球蟲E.stiedai與無殘艾美耳球蟲E.irresidua，對上述蟲種以EtMic2單克隆抗體進(jìn)行IFA染色后，在和緩艾美耳球蟲(圖1-2)、斯氏艾美耳球蟲(圖1-3)和無殘艾美耳球蟲(圖1-4)子孢子頂部均檢測到特異性熒光，只是兔球蟲與雞球蟲相比，熒光強(qiáng)度較弱(圖1)。

3 討論

本研究以一株EtMic2單克隆抗體為檢測抗體檢測Mic 2蛋白在艾美耳屬球蟲的空間分布，研究結(jié)果顯示，無論是雞球蟲還是其他物種球蟲蟲種的Mic 2蛋白均可以被EtMic2單抗識別，特異性熒光均出現(xiàn)在子孢子頂部且著色形式?jīng)]有差異。研究結(jié)果初步說明，Mic 2蛋白在不同種艾美耳屬球蟲相對保守，亦或是EtMic2單抗針對的抗原表位位于Mic 2蛋白保守區(qū)域；熒光強(qiáng)度略有差異，反映出Mic 2蛋白在不同種球蟲中表達(dá)量存在差異。

艾美耳屬球蟲是一個大家族，已命名的大約有1 040種(索勛等, 1998)，本研究只是選取了寄生于雞和兔的4種艾美耳屬球蟲，只能部分反應(yīng)Mic 2蛋白在艾美耳屬球蟲的空間分布，尋找其空間分布的共性尚需進(jìn)行大量樣本的檢測。但是，雞球蟲、兔球蟲的蟲種差異很大(Long, 1982)，它們的Mic 2蛋白均可被EtMic2單抗所識別，亦能部分說明Mic 2蛋白在艾美耳屬球蟲中的保守性，因此，關(guān)于EtMic2蛋白功能的研究也可為研究其他艾美耳屬球蟲提供借鑒。

蛋白的空間分布形式往往決定了其激發(fā)宿主免疫應(yīng)答的類型，如轉(zhuǎn)基因球蟲靶向不同部位的模式抗原(黃色熒光蛋白，EYFP)激發(fā)宿主不同類型的免疫應(yīng)答，靶向球蟲微線體部位(分泌型蛋白)的EYFP偏向激發(fā)宿主Th 2型免疫應(yīng)答；而定位于柔嫩艾美耳球蟲子孢子細(xì)胞核(非分泌型蛋白)的模式抗原偏向激發(fā)宿主Th 1型免疫應(yīng)答(Huangetal., 2011)。提示我們，研究球蟲不同組分激發(fā)宿主免疫應(yīng)答的類型可以首先判斷其空間分布形式，是分泌型蛋白(如與Mic 2共定位)還是非分泌型蛋白，進(jìn)而為后續(xù)研究該組分激發(fā)宿主的免疫應(yīng)答的類型奠定基礎(chǔ)，進(jìn)一步解析球蟲激發(fā)宿主免疫應(yīng)答的機(jī)理。