表達(dá)H9N2禽流感病毒HA1蛋白的轉(zhuǎn)基因和緩艾美耳球蟲的構(gòu)建*

秦 梅 湯新明 劉賢勇 陶鴿如 索靜霞 田秀玲 索 勛

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

禽流感是禽類最為常見的傳染病之一，對養(yǎng)殖業(yè)危害巨大。不僅高致病性禽流感病毒具有重大的公共衛(wèi)生學(xué)意義，低致病性禽流感病毒同樣可以給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大損失，引起雞產(chǎn)蛋率下降，甚至與其他病原體共感染導(dǎo)致雞群的高死亡率(Biswasetal., 2008)，還對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，尤其是H9N2 禽流感病毒，不僅流行于全世界，而且還可以感染人(Buttetal., 2010; Chengetal., 2011)?，F(xiàn)代化養(yǎng)殖業(yè)中，免疫預(yù)防是控制畜禽疫病流行最基本最有效的手段。盡管疫苗在禽流感等疫病的防控中發(fā)揮了重要作用，但目前仍存在不少問題，如不同品系的雞需要經(jīng)過多次肌肉注射疫苗免疫，這樣會(huì)給雞造成很大應(yīng)激，致使生產(chǎn)性能嚴(yán)重下降，因此，迫切需求一種可以采用溫和粘膜免疫途徑的優(yōu)秀疫苗。

雞球蟲是一種寄生于腸道的頂復(fù)門原蟲，其生物安全性很高——感染為自限性且只有唯一宿主；球蟲系一類真核生物，可以表達(dá)已糖基化修飾(具有更強(qiáng)的抗原活性，如HA蛋白的糖基化位點(diǎn)與其抗原性密切相關(guān))的活性抗原蛋白(Lillehoj, 1994)；口服接種簡單易行，省時(shí)省力等。研究證實(shí)球蟲可以刺激宿主產(chǎn)生良好的粘膜免疫應(yīng)答，產(chǎn)生的sIgA和循環(huán)抗體IgY在初免后一周內(nèi)即可高水平表達(dá)，感染8～14 d后達(dá)到峰值，抗體水平可維持?jǐn)?shù)月之久(Lillehojetal., 1987)。細(xì)胞免疫應(yīng)答是宿主抵抗球蟲感染的主要免疫機(jī)制。球蟲感染雞群后，CD8+T 細(xì)胞被招募至腸粘膜組織發(fā)揮細(xì)胞免疫應(yīng)答(Lillehojetal., 2000)；若雞球蟲作為疫苗載體表達(dá)其他病原的保護(hù)性抗原，那么就可以激發(fā)宿主產(chǎn)生良好的細(xì)胞免疫應(yīng)答和粘膜免疫應(yīng)答。因此，轉(zhuǎn)基因球蟲活載體疫苗有望成為繼致弱細(xì)菌和病毒載體疫苗之后更加理想的粘膜免疫疫苗。

自1993年轉(zhuǎn)染技術(shù)首次在弓形蟲中操作成功以來，頂復(fù)門原蟲的轉(zhuǎn)染研究得到了快速發(fā)展(Soldatietal., 1993)，雞柔嫩艾美耳球蟲Eimeriatenella已經(jīng)實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(Haoetal., 2007; Yanetal., 2009)。和緩艾美耳球蟲致病力弱(Tyzzer,1929; Joyner, 1958; Shirleyetal., 1983; 朱珊珊等，2007)、免疫原性強(qiáng)(湯新明等，未發(fā)表數(shù)據(jù))，是作為疫苗活載體的又一良好選擇。但是，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是發(fā)展轉(zhuǎn)基因和緩艾美耳球蟲作為疫苗載體的必要條件，因此，在本研究中，我們用和緩艾美耳球蟲成功穩(wěn)定表達(dá)H9N2禽流感病毒主要保護(hù)性抗原-血凝素HA1蛋白，為和緩艾美耳球蟲作為H9N2禽流感病毒的疫苗活載體奠定了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和蟲株

1日齡AA肉雞由北京華都肉雞公司提供，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室飼喂不含任何抗生素的全價(jià)料，于育雛隔離器內(nèi)飼養(yǎng)。本研究采用和緩艾美耳球蟲涿州株來源，由本實(shí)驗(yàn)室分離和保存。

1.2 和緩艾美耳球蟲子孢子的提取

參照文獻(xiàn)(Longetal.,1975; Huangetal., 2011; Yinetal., 2011)：取5×107個(gè)新鮮艾美耳球蟲卵囊，3000 r/min離心5 min，收集沉淀。用滅菌的pH 7.6的PBS洗滌卵囊沉淀3次。將玻璃研磨器置于冰上研磨卵囊，至90%的卵囊破壁，孢子囊釋出。利用孢子囊消化液稀釋粗提的孢子囊沉淀至濃度為5.0×106個(gè)/mL。將稀釋后的懸液于42 ℃水浴鍋中孵育45 min至約90%的子孢子釋出。停止消化后，將所得的懸液3 000 r/min離心3 min，棄去上清。并用PBS洗滌沉淀。收集子孢子的粗提物沉淀，再用甘氨酸洗脫液(0.75 g 甘氨酸，7.9 g NaCl溶于400 mL Mili-Q超純水，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至 7.6～8.0，補(bǔ)水至500 mL，高壓滅菌)將子孢子粗提物重懸，向DE-52纖維素層析柱上緩緩加入子孢子粗提懸液，打開恒流泵并開始用離心管收集子孢子。收集期間不斷向柱中加甘氨酸洗脫液，同時(shí)用玻璃棒輕輕攪動(dòng)纖維素表層。當(dāng)鏡檢至每個(gè)視野中(10倍光鏡下)子孢子減少至10個(gè)左右時(shí)，停止收集。將所得的子孢子懸液2000 r/min離心10 min，收集子孢子沉淀。

1.3 球蟲載體的構(gòu)建

本研究室已有的pMIC-EYFP/ACT-RFP 質(zhì)粒(Yinetal.,2011)經(jīng)AgeI和SacII、KpnI 和AvrII 酶切后得到的骨架連接禽流感病毒H9N2 HA1和TgDHFR-EYFP基因分別代替RFP 和EYFP基因，得到雙框表達(dá)載體雙框表達(dá)載體質(zhì)粒Mic-DHFR-EYFP/ACT-chFcGPI-ACT (pMDEAAsschFcGPIA)。酶切鑒定后按照提取質(zhì)粒試劑盒說明書大量提取質(zhì)粒(北京艾德萊生物科技有限公司)，用SnaBI限制性內(nèi)切酶過夜酶切線性化質(zhì)粒，然后用飽和酚、氯仿抽提酶切產(chǎn)物，最后用滅菌蒸餾水溶解，使DNA濃度在2 μg/μL。

1.4 和緩艾美耳球蟲體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和體內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

用100 μL核轉(zhuǎn)緩沖液(內(nèi)含有10 μg 線性化質(zhì)粒，5 μLSnaBI 內(nèi)切酶，再用核轉(zhuǎn)緩沖液補(bǔ)充至100 μL)將提純后的球蟲子孢子懸起加入至電擊杯中用核轉(zhuǎn)儀U-033程序核轉(zhuǎn)染后接種細(xì)胞或雞只。對體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，1×106球蟲子孢子核轉(zhuǎn)染后接種MDBK 細(xì)胞，18 h后加含150 μg/g的乙胺嘧啶(Sigma-Aldrich Co., St.Louis, Mo., USA)細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染24 h后觀察蟲體發(fā)光情況；對體內(nèi)轉(zhuǎn)染，每只1日齡的AA肉雞泄殖腔接種2×106核轉(zhuǎn)染的球蟲子孢子，接種18 h后，飼喂含150 μg/g的乙胺嘧啶飼料；接種后5～8 d收集卵囊，于孢子化后在熒光顯微鏡下觀察發(fā)光情況，第1代發(fā)光卵囊經(jīng)流式篩選后再次接種無球蟲雞進(jìn)行第2代篩選，同時(shí)飼喂含150 μg/g的乙胺嘧啶飼料，直至發(fā)光率穩(wěn)定即可，轉(zhuǎn)基因球蟲命名為Emi.HA1。

1.5 轉(zhuǎn)基因和緩艾美耳球蟲的鑒定

按照文獻(xiàn)(Liuetal., 2013)提取球蟲基因組和蛋白，分別進(jìn)行PCR，染色體步移技術(shù)(Genome walking)，間接免疫熒光(IFA)和免疫印跡(Western blot)鑒定。

1.5.1 轉(zhuǎn)基因球蟲PCR及插入位點(diǎn)鑒定: 擴(kuò)增片段HA1和YFP的引物序列分別為HA1-F:5′A C C G G T A T G G A G C A G A A G C T G A T T A G C G A G G AG HA1-R:5′C C T A G G G C G A G A G C T G C G G C T G G G C A C G T TG3′;YFP-F: 5′A T G G T G A G C A A G G G C G A G GA3′;YFP-R: 5′A A G C T T C T T G T A C A G C T C GT3′;為檢測外源基因表達(dá)框插入和緩艾美耳球蟲基因組的位點(diǎn)，本研究采用染色體步移技術(shù)，操作程序按照試劑盒說明書(Takara, Dalian, China)進(jìn)行。根據(jù)MIC2啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)特異性引物SP1(5′A A G G C G A G C G A A G C T G T T C A CT3′ )SP2(5′C C A T G C T T G G A G G A A A C T T T GC3′) SP3(5′G C C T C T C G A A G G A T C T G A A T GC3′)，4個(gè)隨機(jī)引物AP1、AP2、AP3、AP4為試劑盒中提供。第3輪PCR擴(kuò)增出的條帶切膠回收后連接pEASY-T1-simple vector (TransGen Biotech)，對測序后的序列用DNAStar7.0軟件進(jìn)行分析，并用E.mitisDB database對插入的位點(diǎn)進(jìn)行序列比對(Kimetal., 2004)。

1.5.2 和緩艾美耳球蟲表達(dá)流感病毒HA1蛋白鑒定：用提取的轉(zhuǎn)基因球蟲全蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，原核表達(dá)的HA1蛋白作為陽性對照，野生球蟲蛋白作為陰性對照，然后轉(zhuǎn)PVDF膜，鼠源HA1蛋白多抗作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，然后化學(xué)發(fā)光顯色。

1.5.3 轉(zhuǎn)基因球蟲表達(dá)的外源蛋白HA1在子孢子中的定位：經(jīng)DE-52纖維素層析柱純化后子孢子用預(yù)冷的丙酮固定在多聚賴氨酸處理過的載玻片上-20 ℃ 20 min，PBS洗3遍后用0.1% X-100 穿膜15 min，隨后用1% BSA 封閉60 min，鼠源HA1蛋白多抗作為一抗孵育1 h，PBS洗4遍后用Cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗孵育1 h，PBS洗4遍后封片。在激光共聚焦顯微鏡(SP5, Leica, Germany)下觀察蛋白定位情況。

1.6 轉(zhuǎn)基因球蟲與野生球蟲繁殖力比較

8只1周齡的AA肉雞隨機(jī)分為兩組，分別感染1 000個(gè)表達(dá)H9N2禽流感病毒HA1的轉(zhuǎn)基因球蟲和野生球蟲，于感染后5～11 d間隔24 h 后取糞便樣品用麥克馬良計(jì)數(shù)板進(jìn)行卵囊計(jì)數(shù)，最后繪制轉(zhuǎn)基因球蟲和野生球蟲感染后5～11 d的排卵囊曲線。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因和緩艾美耳球蟲雙框表達(dá)載體的構(gòu)建

將禽流感病毒H9N2的HA1基因片段從實(shí)驗(yàn)室已有載體中酶切膠回收后連接入球蟲骨架載體(本研究室已構(gòu)建好的載體)得到最終載體pMic-DHFR-EYFP-Actin/Actin-HA1-Actin(圖1-A)，經(jīng)酶切鑒定，質(zhì)粒構(gòu)建完全正確(圖1-B)。

圖1 表達(dá)H9N2禽流感病毒HA1蛋白轉(zhuǎn)基因和緩艾美耳球蟲載體的構(gòu)建Fig.1 Construction of vector expressing HA1 region of H9N2 influenza virusA. 轉(zhuǎn)染用載體pMic-DHFR-EYFP-Actin/Actin-HA1-Actin轉(zhuǎn)基因球蟲載體圖。ss：弓形蟲致密顆粒8信號肽。B.雙框表達(dá)載體的鑒定。a. AgeI和SacII的酶切鑒定。1：未酶切的質(zhì)粒；2：AgeI和SacII酶切后的質(zhì)粒。b. 轉(zhuǎn)染用的線性化質(zhì)粒酶切鑒定圖。1：未酶切的質(zhì)粒；2：SnaBI酶切后的線性化質(zhì)粒。M: D2000 plus marker。A. Expression cassettes are shown as colored boxes. The EYFP coding region is flanked by the MIC2 promoter and 3′region of actin derived from E. tenella; while the foreign protein region is flanked by the promoter of actin (Act), 3′region of actin and signal sequence(ss, 84 bp) derived from dense granule protein 8 (GRA8) of T. gondii. B. Identification of double cassettes. a. Digestion identification. 1: Undigested plasmid; 2: Digested plasmid with AgeI and SacII. b. Linearized plasmid for transfection.1: Undigested plasmid; 2: Digested plasmid with SnaBI. M：D2000plus marker.

2.2 轉(zhuǎn)基因和緩艾美耳球蟲的體外瞬時(shí)和體內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

由圖中可以看出，子孢子接種24 h，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的子孢子表達(dá)黃色熒光蛋白(圖2-A)。轉(zhuǎn)染后的子孢子泄殖腔接種肉雞后，收集接種后5～8 d的卵囊，孢子化后在熒光顯微鏡下可觀察到發(fā)光卵囊，然后在雞體內(nèi)連續(xù)傳代，第1代的發(fā)光率為0.2%，第3代時(shí)發(fā)光率達(dá)到60%(圖2-B)，之后又連續(xù)兩代傳代，發(fā)光率穩(wěn)定在90%，未孢子化卵囊是不發(fā)熒光的，這與質(zhì)粒元件Mic啟動(dòng)子有關(guān)，Mic是一個(gè)階段性表達(dá)蛋白，在未孢子化階段不表達(dá)黃色熒光蛋白。與本研究室只用流式篩選相比(Huangetal., 2011; Yinetal., 2011)，藥篩和流式雙篩選的方法大大提高了轉(zhuǎn)基因球蟲的篩選效率，為更快獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因球蟲進(jìn)行后續(xù)球蟲生物學(xué)和免疫學(xué)等研究奠定基礎(chǔ)。

圖2 轉(zhuǎn)基因和緩艾美耳球蟲體外瞬時(shí)和體內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Fig.2 Transfection with pMic-DHFR-EYFP-Actin/Actin-HA1-Actin in vitro and in vivoA：質(zhì)粒pMic-DHFR-EYFP-Actin/Actin-HA1-Actin轉(zhuǎn)染子孢子后接種MDBK細(xì)胞；B：轉(zhuǎn)基因和緩艾美耳球蟲第3代的熒光圖；C：用confocal 顯微鏡拍攝的發(fā)光卵囊。Bar=10 μm。A. Sporozoites transfected with the plasmid in a MDBK cell; B. Fluorescence Emi. HA1 oocysts at the third passage; C. Fluorescent Emi.HA1 oocysts was observed by confocal microscope.

2.3 轉(zhuǎn)基因和緩艾美耳球蟲基因水平和蛋白水平鑒定

用第4代的發(fā)光Emi. HA1卵囊提取基因組，分別用HA1和YFP特異性引物PCR擴(kuò)增，得到預(yù)期片段大小的條帶(圖3-A，HA1,1 000 bp, YFP, 750 bp)；為確定質(zhì)粒插入和緩艾美耳球蟲基因組的位點(diǎn)，本研究利用染色體步移技術(shù)對插入位點(diǎn)進(jìn)行了鑒定，圖3-B為每條隨機(jī)引物的3輪PCR圖，對陽性克隆進(jìn)行測序，檢測到一個(gè)插入位點(diǎn)(Emh_4754)(圖3-C)，由于此位點(diǎn)序列還沒有被注釋，因此我們暫時(shí)無法確定質(zhì)粒整合的具體位置。Western blot 結(jié)果顯示和緩艾美耳球蟲成功表達(dá)了禽流感病毒H9N2的HA1 片段，由于原核表達(dá)載體中帶有兩個(gè)His 標(biāo)簽大小為12 kDa，因此蛋白要比球蟲表達(dá)的大(圖3-D)；間接免疫熒光結(jié)果顯示HA1蛋白主要位于子孢子細(xì)胞膜和子孢子頭部(圖3-E)。

圖3 轉(zhuǎn)基因和緩艾美耳球蟲基因表達(dá)外源蛋白的鑒定Fig.3 Validation of the stable transfected E. mitisA. PCR 鑒定。1: 陽性質(zhì)粒; 2, 4: 轉(zhuǎn)基因和緩艾美耳球蟲基因組; 3, 5: 野生和緩艾美耳球蟲基因組. B. Genome walking電泳圖。AP1-4是4個(gè)隨機(jī)引物; 1, 2, 3: 3輪PCR; M: DL 2000 plus marker。C. 外源基因HA1基因在球蟲基因組中的插入位點(diǎn)。D. 和緩艾美耳球蟲表達(dá)HA1的蛋白鑒定。1: 原核表達(dá)HA1蛋白Pet28aHA1陽性對照；2: Emi.HA1. E. IFA鑒定，原核表達(dá)HA1蛋白鼠源多抗作為一抗。a, b: 用穿膜劑處理; c, d: 不用穿膜劑處理。A. Detection of HA1 and YFP genes by PCR. 1：PCR products from plasmid pHEAAssHA1chFcA (positive control); 2, 4: DNA extracted from Emi.HA1; 3, 5: DNA extracted from wild type of E. mitis (negative control); M: DL plus 2000 molecular weight ladder. B. Gel electrophoresis of amplified products after the three nested genome walking PCRs. 1-3：Represents rounds of PCR; AP1-4: Random primers from genome walking kit; M: DL plus 2000 marker. C. Integrated sites of plasmid expression cassettes into E. mitis genome by genome walking. D. Detection of recombined HA1 protein by Western blot with mouse HA1 protein polyclonal antibody. 1: Purified HA1 protein expressed in E.coli (positive control); 2: Protein extracted from Emi.HA1; 3: Protein from wild type of E.mitis (negative control). E. IFA identification of sporozoites of Emi.HA1. a, b: Permeation treatment; c, d, Without permeation treatment.

2.4 轉(zhuǎn)基因和緩艾美耳球蟲的繁殖力

由圖4可以看出，轉(zhuǎn)基因和緩艾美耳球蟲Emi.HA1與野生球蟲的繁殖力具有較高的相似性，感染后第6 d達(dá)到排卵囊高峰，平均每只雞可排2×107個(gè)卵囊。

圖4 轉(zhuǎn)基因和緩艾美耳球蟲和野生球蟲排卵囊曲線比較Fig. 4 Comparison of the oocyst shedding pattern of Emi.HA1 with that of the wild type strain感染后5～11 d間隔24 h進(jìn)行卵囊計(jì)數(shù)。One group of four chickens were infected with 1 000 Emi.HA1, another group received 1 000 wild type parasites. Oocyst shedding was measured every 24 h between 5 d and 11 d post infection.

3 討論

頂復(fù)門原蟲的轉(zhuǎn)基因操作為其生物學(xué)研究提供了強(qiáng)有力的工具。近幾年來，轉(zhuǎn)基因球蟲的研究取得了很大進(jìn)展，同時(shí)也促進(jìn)了球蟲免疫學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。柔嫩艾美耳球蟲已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，促進(jìn)了艾美耳球蟲作為疫苗載體的研究進(jìn)展。和緩艾美耳球蟲亦寄生于消化道，但其致病力弱(Tyzzer,1929; Joyner 1958; Shirley, 1983; 朱珊珊等，2007)、免疫原性強(qiáng)(未發(fā)表數(shù)據(jù))，是作為疫苗活載體的又一良好選擇。本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)H9N2禽流感病毒HA1蛋白的轉(zhuǎn)基因和緩艾美耳球蟲，其繁殖力與野生球蟲相當(dāng)，提示獲得的轉(zhuǎn)基因和緩艾美耳球蟲株具有作為疫苗活載體的潛能。

研究已表明藥物和流式共篩選的篩選效率顯著高于只用流式篩選的效率(Clarketal., 2008)。以乙胺嘧啶抗性基因和黃色熒光蛋白基因?yàn)楹Y選框的雙框表達(dá)載體已利用核轉(zhuǎn)染的方式轉(zhuǎn)染弓形蟲得到了驗(yàn)證，為其在轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)(湯新明等，2014)。在本研究中利用此雙框表達(dá)載體雙篩選的方法第3代發(fā)光率即可達(dá)到60%，與以往本研究室只用流式篩選的方法相比大大提高了轉(zhuǎn)基因球蟲的篩選速度。

本研究中的轉(zhuǎn)基因和緩艾美耳球蟲系Emi.HA1的排卵囊時(shí)間曲線與野生株一致；與之前報(bào)道的表達(dá)流感病毒M2e的轉(zhuǎn)基因柔嫩艾美耳球蟲株相似(Liuetal., 2013)；而與前人報(bào)道的柔嫩艾美耳球蟲穩(wěn)定轉(zhuǎn)染群體TE1排卵囊時(shí)間相對延遲12 h (Yanetal., 2009)，本研究室另外一轉(zhuǎn)基因和緩艾美耳球蟲系的排卵囊時(shí)間與野生株相比相對延遲24 h(未發(fā)表數(shù)據(jù))。這些研究結(jié)果之間的差異可能是由于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒隨機(jī)插入球蟲基因組所造成的，在本研究中我們檢測到一個(gè)插入位點(diǎn)，其可能通過破壞宿主基因或外源基因的表達(dá)對轉(zhuǎn)基因球蟲的表型如繁殖力、排卵囊高峰造成影響 (Yanetal., 2009)。

研究表明，表達(dá)外源蛋白的轉(zhuǎn)基因球蟲免疫后可以激發(fā)宿主產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答。以表達(dá)黃色熒光蛋白(YFP)為模式抗原的柔嫩美耳球蟲經(jīng)口服免疫后可以激發(fā)雞體產(chǎn)生較好的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答(Huangetal., 2011)；用表達(dá)彎曲桿菌CjaA蛋白的柔嫩艾美耳球蟲口服免疫后可激發(fā)產(chǎn)生針對CjaA蛋白特異性的免疫應(yīng)答，使腸道彎曲桿菌減少86%～91%(Clarketal., 2012)。轉(zhuǎn)基因球蟲表達(dá)外源蛋白的量對宿主激發(fā)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答至關(guān)重要，但是前人尚未對球蟲表達(dá)外源蛋白的量進(jìn)行研究。其中一個(gè)解決方法是用致病力較弱的球蟲作為疫苗載體，可以通過增大免疫劑量來提高球蟲在雞體內(nèi)表達(dá)外源蛋白的量，從而達(dá)到產(chǎn)生較強(qiáng)免疫應(yīng)答的目的。目前堆型艾美耳球蟲Eimeriaacervulina、巨型艾美耳球蟲E.maxima和早熟艾美耳球蟲E.praecox等球蟲已經(jīng)實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(Zouetal., 2009)，發(fā)展致病力較弱的球蟲作為疫苗載體進(jìn)而產(chǎn)生針對致病性病原特異性的免疫保護(hù)具有很大潛能(Liuetal., 2013)。其他增強(qiáng)球蟲表達(dá)外源蛋白量的策略還需要進(jìn)一步研究。本研究成功篩選出穩(wěn)定表達(dá)H9N2禽流感病毒HA1的轉(zhuǎn)基因和緩艾美耳球蟲，為進(jìn)一步研究此轉(zhuǎn)基因和緩艾美耳球蟲激發(fā)宿主產(chǎn)生針對H9N2禽流感病毒的免疫保護(hù)性奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。