毛細(xì)管電泳法分離6種手性化合物

呂迎春，樊竹青，侯云洪

(普洱學(xué)院 生命科學(xué)系，云南普洱665000)

毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis，CE)是20世紀(jì)80年代崛起的一種分離分析技術(shù)。從1985年Gassmann E.［1］首次應(yīng)用于手性分離以來，由于該技術(shù)具有分離效率高、分析時間短、樣品耗費少等優(yōu)點，已被迅速應(yīng)用于手性分離［2－7］。環(huán)糊精分子呈籠狀結(jié)構(gòu)并含有多個手性中心，它能與客體分子形成超分子化合物，從而對客體分子產(chǎn)生多重的分子識別能力［8］。因此，環(huán)糊精類手性選擇劑是目前毛細(xì)管電泳手性分離應(yīng)用得最廣的手性選擇劑。

氧氟沙星屬于第三代氟喹諾酮類廣譜抗菌藥，其分子結(jié)構(gòu)中具有一個手性碳原子，從而產(chǎn)生S－(－)和R－(+)兩種光學(xué)異構(gòu)體。近年來研究證明，左旋氧氟沙星抗革蘭氏陽性菌及陰性菌的活性是右旋的8～128倍，是氧氟沙星外消旋體的2倍［9］，其不良反應(yīng)比氧氟沙星外消旋體低。因此，獲取抗菌能力強且毒副作用小的左氧氟沙星有著重要意義。布洛芬屬于非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥，具有鎮(zhèn)痛、退熱等作用，它主要通過可逆性的抑制環(huán)氧化酶來抑制作為炎癥介質(zhì)的各種前列腺素的生成，起到解熱鎮(zhèn)痛抗炎的藥理作用。其分子結(jié)構(gòu)中在β位有一個手性碳原子，存在一對光學(xué)異構(gòu)體S－構(gòu)型和R－構(gòu)型，其中只有S－布洛芬具有主要的生理活性作用，而R－構(gòu)型不僅活性低且有副作用。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CL1020高效毛細(xì)管電泳儀(UV紫外檢測器波長范圍190～700 nm)和HW-2000色譜數(shù)據(jù)工作站，北京彩陸科學(xué)儀器有限公司;未涂層熔融石英毛細(xì)管(50 cm×50 um，有效長度41 cm)，河北永年光導(dǎo)纖維廠;羥丙基－β－環(huán)糊精(HP－β－CD)購于Sigma公司;氫氧化鈉、磷酸均為國產(chǎn)分析純試劑。實驗所用6種對映體標(biāo)準(zhǔn)品均購于中國藥品生物制品檢定所。分子結(jié)構(gòu)見圖1。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制

將手性化合物分別溶于10 mmol/L NaOH溶液中，配制成濃度為4 mmol/L的溶液后進行超聲溶解并保存于4℃環(huán)境中，在分析前再用背景電解質(zhì)溶液進行適當(dāng)稀釋。

于70 mmol/L H3PO4溶液中加入pH分別為1.0、2.1、2.5、3.0、3.8、4.3、5.0、6.0 和 7.0 的緩沖溶液，將一定量的HP－β－CD溶于其中。樣品和緩沖溶液用0.45 μm濾膜(水系)過濾，使用前在超聲波上脫氣5～10 min。

1.2.2 電泳條件

毛細(xì)管使用前分別用0.5 mol/L NaOH溶液、水及緩沖溶液各沖洗3 min。采用壓力進樣，進樣壓力 3.06 kPa，進樣時間 3 s，分離溫度25℃。

圖1 6種手性化合物的結(jié)構(gòu)Figure 1 Structures of 6 chiral compounds

2 結(jié)果與討論

2.1 氧氟沙星對映體的分離

在分離氧氟沙星對映體時，如果背景電解質(zhì)溶液的pH值大于4.3，則峰形變差。選擇pH為2.1，羥丙基－β－環(huán)糊精的濃度為40 mmol/L，分離電壓為10 kV，檢測波長為254 nm時，可在短時間內(nèi)對氧氟沙星實現(xiàn)手性分離且重現(xiàn)性好。

在利用毛細(xì)管電泳分離氧氟沙星對映體的基礎(chǔ)上，將左旋的氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品加入到其對映體混合物中，對其譜圖進行研究分析表明:對映體出峰的順序為S－(－)－氧氟沙星先出峰，R－(+)－氧氟沙星后出峰，如圖2－A所示。

2.2 特布他林對映體的分離

羥丙基－β－環(huán)糊精的濃度為40 mmol/L，分離電壓為10 kV，檢測波長為210 nm，調(diào)節(jié)磷酸鹽緩沖溶液的pH對出峰時間有明顯影響。pH值為6.0的出峰時間明顯比pH為2.5時的出峰時間短，其對應(yīng)譜圖分別為圖2－B(1)、圖2－B(2)所示。

2.3 克倫特羅對映體的分離

磷酸鹽緩沖溶液pH值為2.5，羥丙基－β－環(huán)糊精溶液濃度為40 mmol/L，檢測波長254 nm。調(diào)節(jié)電壓分別為10、12、15 kV時，其CE譜圖分別為2－C(1)、圖2－C(2)和圖2－C(3)所示。分析譜圖顯示隨著電壓的增大，出峰時間明顯縮短，但峰高也變矮，因此選擇電壓12 kV時分離效果比較理想。

2.4 美托洛爾的分離

選取濃度為40 mmol/L的羥丙基－β－環(huán)糊精溶液，電壓為10 kV，檢測波長為204 nm時，研究了改變磷酸鹽緩沖溶液(70 mmol/L)pH對美托洛爾對映體分離效果的影響。實驗結(jié)果表明在pH值為6.0緩沖溶液環(huán)境下能實現(xiàn)美托洛爾的基線分離(圖2－D)。

2.5 扁桃酸的分離

選擇濃度為40 mmol/L的羥丙基－β－環(huán)糊精溶液，電壓為15 kV，檢測波長為206 nm時，改變磷酸鹽緩沖溶液(70 mmol/L)pH分別為2.5、5.0、6.0、7.0時，對扁桃酸對映體分離的研究。結(jié)果顯示磷酸鹽緩沖溶液pH=6.0時，能實現(xiàn)對扁桃酸的分離(見圖2－E)。

2.6 苯基丁二酸

選取濃度為40 mmol/L的羥丙基－β－環(huán)糊精溶液，電壓為10 kV，檢測波長為254 nm時，改變磷酸鹽緩沖溶液(70 mmol/L)pH分別為2.5、5.0、6.0、7.0時，對扁桃酸對映體分離的研究。結(jié)果顯示磷酸鹽緩沖溶液pH=6.0時，能實現(xiàn)苯基丁二酸的手性分離(見圖2－F)。

圖2 各手性化合物拆分的電泳圖Figure 2 Electropherograms of chiral compounds

3 結(jié)論

從上述結(jié)果得出，羥丙基－β－環(huán)糊精是一種理想的CE手性添加劑。以40 mmol/L的羥丙基－β－環(huán)糊精溶液、磷酸鹽緩沖溶液(70 mmol/L)pH為6.0、電壓10 kV，分離溫度為25℃時，僅改變檢測波長分別為254、210、204時，可同時實現(xiàn)苯基丁二酸、特布他林、美托洛爾等3種對映體的手性分離;以40 mmol/L的羥丙基－β－環(huán)糊精溶液，電壓10 kV，分離溫度為25℃，檢測波長為254 nm時，僅改變磷酸鹽緩沖溶液(70 mmol/L)pH值分別為2.1、2.5時就能實現(xiàn)氧氟沙星、克倫特羅的手性分離。因此，僅對少數(shù)影響分離條件的調(diào)整，即可實現(xiàn)幾種對映體的分離，從而提高了工作效率。同時，氧氟沙星對映體出峰順序的確定可為與氧氟沙星結(jié)構(gòu)相似的對映體毛細(xì)管電泳分離提供定性分析的依據(jù)。

［1］Gassmann E，Kuo J E，Zare R N.Electrokinetic separation of chiral compounds［J］.Science，1985，230:813-814.

［2］Arai T，Nimura N，Kinoshita T.Investigation of enantioselective ofloxacin-albumin binding and displacement interactions using capillary affinity zone electrophoresis［J］.Biomedical chromatograpiiy，1995，9:68-74.

［3］Zhou S，Ouyang J，Baeyens W R，et al.Chiral separation of four fluoroquinolone compounds using capillary electrophoresis with hydroxypropyl-β-cyclodextrin as chiral selector［J］.Chromatogr.A，2006，1130:296-301.

［4］王偉，張永利，董英茹，等.毛細(xì)管電泳法手性分離5種堿性藥物［J］.藥物分析雜志，2007，27:1984-1987.

［5］俞犄，王義明，羅國安.俞氧氟沙星對映體的毛細(xì)管電泳手性分離［J］.藥學(xué)學(xué)報，1997，32:203-206.

［6］韋壽蓮，鄧光輝.手性藥物的毛細(xì)管電泳拆分［J］.分析測試學(xué)報，2007，26:907-910.

［7］Abushoffa A M，F(xiàn)illet M，Hubert P，et al.Chiral separation of basic drugs capillary electrophoresis with carboxymethylcyclodextrins［J］. Chromatogr. A，2002，948:321-329.

［8］袁黎明.手性識別材料［M］.北京:科學(xué)出版社，2010.

［9］Hayakawa I，Atarashi S，Yokohama S，et al.Synthesis and antibacterial activities of optically active ofloxacin［J］.Antimicrob.Agents Chemother.，1986，29:163-164.