葉下珠水提物對裸鼠人肝癌移植瘤HBx和VEGFR3表達(dá)的影響

魏春山，唐海鴻，王宏艷，邢宇鋒，童光東，周大橋

（1.深圳市中醫(yī)院肝病科，廣東 深圳 518033；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院感染科，湖北 武漢 430074）

目前認(rèn)為，乙型肝炎病毒X基因（hepatitis B virus x gene，HBx）對于乙型肝炎相關(guān)肝癌的形成和進(jìn)展起到關(guān)鍵作用，而腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移賴以血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptors，VEGFRs），其中VEGFR3主要作用于淋巴通路［1］，其與HBx是否存在相互作用及其機(jī)制尚不得而知。本研究通過復(fù)制轉(zhuǎn)染HBx基因、VEGFR3基因和氯霉素乙酞轉(zhuǎn)移酶（chloramphenicol acetyltransferase，CAT）基因的肝癌皮下移植瘤模型，并用中藥葉下珠水提物（the aqueous extract ofphyllanthusurinariaL.，AEP）進(jìn)行干預(yù)，擬探討HBx和VEGFR3在乙型肝炎相關(guān)肝癌中的作用。

1 材料

穩(wěn)定 人 肝 癌 細(xì) 胞 株 HepG2－HBx，HepG2－CAT，HepG2－VEGFR3，由本課題組前期通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建，液氮凍存于本院中心實驗室。AEP，由本課題組采用乙醇水提取法制備［2］。環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，Cytoxan，CTX）針劑（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字號為H32020857，批號 11031921）。裸鼠（Balb／c－nu 裸小鼠）60只，購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心（實驗動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（粵）2006－0015；編號：0083740），4周齡，雄性，體質(zhì)量10.87～17.21g。VEGFR3兔多抗、HBx單抗（Abcam）等，購自廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司，按試劑盒說明書操作。其他實驗材料由廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子免疫研究所提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞制備［3］將液氮凍存細(xì)胞HepG2－HBx，HepG2－CAT，HepG2－VEGFR3分別按常規(guī)復(fù)蘇、傳代、擴(kuò)增，檢測細(xì)胞活力，調(diào)細(xì)胞濃度至1.0×107／ml。

2.2 動物管理 裸鼠（實驗動物使用許可證號：SYXK（粵）2008－0001）在3種肝癌細(xì)胞擴(kuò)增完成前1周購買，立即進(jìn)行編號、稱體質(zhì)量、分裝，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF實驗室（編號0058667），25℃室內(nèi)飼養(yǎng)，以適應(yīng)環(huán)境，每周稱體質(zhì)量1次。

2.3 動物分組 通過SPSS 17.0隨機(jī)數(shù)字法，對動物進(jìn)行隨機(jī)分組，每組6只，共10組（G1—G10），常規(guī)飼養(yǎng)1周后復(fù)制肝癌移植瘤模型，模型復(fù)制成功后按照分組分別進(jìn)行藥物干預(yù)（見表1）。

表1 接種不同肝癌細(xì)胞的裸鼠分組及藥物處理因素

2.4 模型復(fù)制方法 收集1.0×107／ml的目的細(xì)胞懸液，外包裝滅菌后送入實驗動物中心。模型復(fù)制前稱量裸鼠體質(zhì)量。G1組每只頸背部皮下注射0.2ml生理鹽水。G2—G10組每只頸背部皮下分別注射1.0×107／ml輕輕搖勻的目的細(xì)胞0.2ml。注射后可見注射部位一圓形或橢圓形粟米大小皮丘狀突起，局部皮膚發(fā)白。

2.5 給藥劑量和方法 AEP口服給藥劑量為14.25 g／kg（相當(dāng)于成人劑量的12.5～18.0倍），采用灌胃法，每周6次。CTX給藥劑量（注射劑量）為每只小鼠46.57mg／kg（相當(dāng)于成人臨床用量的20倍）。NS用法：與AEP等容積灌胃，按每只小鼠46.57 mg／kg腹腔注射CTX，每周5次。按CTX使用療程，共使用30次（1個療程），療程結(jié)束時采集標(biāo)本。

2.6 取材 療程結(jié)束時稱量裸鼠體質(zhì)量，常規(guī)摘除眼球取血，頸椎脫臼法處死，取腫瘤、肝臟等新鮮組織。

2.7 觀察指標(biāo)及檢測 分別觀察實驗動物體質(zhì)量；瘤體質(zhì)量、形態(tài)等；酶聯(lián)免疫吸附法測定血清甲胎蛋白（alpha fetal protein，AFP）水平；Western blot檢測瘤組織HBx、VEGFR3蛋白表達(dá)。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。連續(xù)型變量采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)描述。因素內(nèi)和（或）因素間均數(shù)差異比較，采用單因素方差分析、兩因素析因設(shè)計的方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，均數(shù)多重比較采用LSD法。顯著性水準(zhǔn)：α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 各組裸鼠移植瘤復(fù)制情況 模型復(fù)制后第7天，接種3種肝癌細(xì)胞的各組裸鼠瘤體直徑已達(dá)0.5～0.8cm，質(zhì)感稍韌，可在皮下移動，視為模型復(fù)制成功，模型復(fù)制成功率為100%。見圖1。

圖1 裸鼠移植瘤模型（示頸背部皮下移植瘤）

3.2 各組裸鼠體質(zhì)量變化比較 裸鼠體質(zhì)量均隨時間增長，經(jīng)重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果顯示不同觀察時間的體質(zhì)量差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。且不同觀察時間與各分組之間也存在交互作用（P＜0.05），在接種肝癌細(xì)胞后第8周，G1組裸鼠體質(zhì)量顯著高于 G2、G4、G5、G7、G8、G10組（P＜0.05，或P＜0.01）。見圖2。

3.3 接種不同肝癌細(xì)胞和接受不同處理因素的裸鼠移植瘤質(zhì)量比較 經(jīng)兩因素析因設(shè)計的方差分析，各組總體方差齊（P＝0.495）。組間分析結(jié)果顯示，接種細(xì)胞因素對腫瘤質(zhì)量差異的主效應(yīng)無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.169）；而處理因素（NS、CTX 及AEP）間及處理因素與接種細(xì)胞間的交互作用均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，或P＜0.01）。進(jìn)一步將處理因素的主效應(yīng)進(jìn)行多重比較，結(jié)果提示兩治療組（CTX組與AEP組）與對照組（NS組）腫瘤質(zhì)量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），但AEP組與CTX組之間腫瘤質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

按接種細(xì)胞進(jìn)行分層，對處理因素的效應(yīng)進(jìn)行多重檢驗，結(jié)果顯示，相同接種細(xì)胞組內(nèi)，CTX組和AEP組與NS組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；接種 HepG2－HBx細(xì)胞各組中，AEP組（G4）腫瘤生長最慢，且與CTX組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示AEP有更好的抑制HBx相關(guān)腫瘤生長的作用；而接種 HepG2－CAT細(xì)胞與HepG2－VEGFR3細(xì)胞的各組中，AEP組和CTX組腫瘤質(zhì)量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

圖2 接種肝癌細(xì)胞后不同時間各組裸鼠體質(zhì)量比較（n＝6）

表2 接種不同肝癌細(xì)胞和接受不同處理因素的裸鼠移植瘤質(zhì)量比較（±s）

表2 接種不同肝癌細(xì)胞和接受不同處理因素的裸鼠移植瘤質(zhì)量比較（±s）

注：與接種同一肝癌細(xì)胞、接受NS處理組比較，＊P＜0.05；與接種同一肝癌細(xì)胞、接受CTX處理組比較，△P＜0.05。

HepG2－HBx NS G2 6 3.17±0.35 CTX G3 6 2.23±0.29＊AEP G4 6 1.60±0.37＊△HepG2－CAT NS G5 6 2.87±0.19 CTX G6 6 1.82±0.19＊AEP G7 6 1.89±0.26＊HepG2－VEGFR3 NS G8 6 3.04±0.22 CTX G9 6 2.00±0.31＊AEP G10 6 2.08±0.39＊

3.4 各組裸鼠血清AFP水平比較 兩因素析因設(shè)計的方差分析結(jié)果顯示，各組總體方差齊（P＞0.05）。接種細(xì)胞因素與處理因素的主效應(yīng)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而處理因素與接種細(xì)胞間的交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。按接種細(xì)胞進(jìn)行分層，對處理因素的效應(yīng)進(jìn)行多重比較，結(jié)果顯示，接種 HepG2－HBx細(xì)胞的各組中，NS組與CTX組、AEP組AFP水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組裸鼠血清AFP水平比較（±s）

表3 各組裸鼠血清AFP水平比較（±s）

注：與接種 HepG2－HBx細(xì)胞、接受NS處理組比較，＊P＜0.05。

NS G1 6 3.08±1.59 HepG2－HBx NS G2 6 2.90±2.35 CTX G3 6 4.90±1.26＊AEP G4 6 4.38±2.55＊HepG2－CAT NS G5 6 5.00±1.51 CTX G6 6 2.70±1.23 AEP G7 6 2.83±1.92 HepG2－VEGFR3 NS G8 6 2.62±1.80 CTX G9 6 3.78±1.02 AEP G10 6 2.73±1.91

3.5 接種HepG2－HBx肝癌細(xì)胞的各組裸鼠移植瘤組織HBx表達(dá)水平 單因素方差分析及事后多重比較結(jié)果顯示，AEP組與CTX組移植瘤組織中HBx表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與NS組比較，AEP組和CTX組移植瘤組織中HBx表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果表明AEP和CTX均具有顯著抑制移植瘤組織中HBx表達(dá)的作用。見圖3和表4。

圖3 接種HepG2－HBx肝癌細(xì)胞的各組裸鼠移植瘤組織HBx表達(dá)水平（Western Blot法）

表4 接種HepG2－HBx肝癌細(xì)胞的各組裸鼠移植瘤組織HBx表達(dá)水平比較（±s）

表4 接種HepG2－HBx肝癌細(xì)胞的各組裸鼠移植瘤組織HBx表達(dá)水平比較（±s）

注：與NS組比較，＊P＜0.05。

NS G2 6 0.036 7±0.004 5 CTX G3 6 0.032 3±0.003 1＊AEP G4 6 0.032 0±0.001 9＊

3.6 接種不同肝癌細(xì)胞的各組裸鼠移植瘤組織中VEGFR3表達(dá)水平比較 兩因素析因設(shè)計的方差分析結(jié)果顯示，各組總體方差齊（P＞0.05）。接種細(xì)胞因素及處理因素的主效應(yīng)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而處理因素與接種細(xì)胞間的交互作用無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。且接種細(xì)胞較處理因素對總變異的貢獻(xiàn)更大（0.785vs0.465）。

按接種細(xì)胞進(jìn)行分層，對處理因素的效應(yīng)進(jìn)行多重比較，結(jié)果顯示，接種相同肝癌細(xì)胞的各組中，AEP組VEGFR3表達(dá)水平最低，但與CTX組表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；AEP組和CTX組VEGFR3表達(dá)水平顯著低于NS組（P＜0.05）。結(jié)果表明AEP具有較好的抑制肝癌細(xì)胞中VEGFR3表達(dá)的作用。

按處理因素進(jìn)行分層，對接種細(xì)胞的效應(yīng)進(jìn)行多重比較，結(jié)果顯示，對于相同的處理因素，接種HepG－VEGFR3細(xì)胞的裸鼠移植瘤組織中VEGFR3表達(dá)水平最高，接種HepG－CAT細(xì)胞的裸鼠移植瘤組織中VEGFR3表達(dá)水平最低，接種HepG－HBx細(xì)胞和HepG－CAT細(xì)胞的裸鼠移植瘤組織中VEGFR3表達(dá)水平均顯著低于接種HepGVEGFR3細(xì)胞的裸鼠移植瘤組織中VEGFR3表達(dá)水平（P＜0.01）。提示HBx蛋白可能具有上調(diào)肝癌細(xì)胞中VEGFR3表達(dá)的作用，AEP可抑制接種3種肝癌細(xì)胞的裸鼠移植瘤組織中VEGFR3的表達(dá)，AEP抑制肝癌移植瘤組織中VEGFR3表達(dá)的作用與HBx蛋白的表達(dá)具有一定關(guān)聯(lián)。見圖4和表5。

圖4 接種不同肝癌細(xì)胞的各組裸鼠移植瘤組織中VEGFR3表達(dá)水平（Western Blot法）

表5 接種不同肝癌細(xì)胞的各組裸鼠移植瘤組織中VEGFR3表達(dá)水平比較（±s）

表5 接種不同肝癌細(xì)胞的各組裸鼠移植瘤組織中VEGFR3表達(dá)水平比較（±s）

注：與接種相同細(xì)胞、接受NS處理組比較，＊P＜0.05。

接種細(xì)胞 處理因素 組別n VEGFR3相對表達(dá)水平HepG2－HBx NS G2 6 0.130 3±0.017 4 CTX G3 6 0.112 5±0.014 1＊AEP G4 6 0.106 7±0.010 3＊HepG2－CAT NS G5 6 0.119 7±0.009 2 CTX G6 6 0.101 3±0.010 5＊AEP G7 6 0.093 7±0.006 6＊HepG2－VEGFR3 NS G8 6 0.161 7±0.011 5 CTX G9 6 0.147 7±0.010 6＊AEP G10 6 0.143 7±0.006 6＊

4 討論

腫瘤血管和淋巴管生成是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的重要條件，VEGF及各VEGFR發(fā)揮著各自不同的作用［4］，其中VEGFR3參與促進(jìn)新生血管的生長，特別是腫瘤淋巴管的生長和發(fā)育，對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移起著獨(dú)特的作用［1］。而在乙型肝炎患者腫瘤形成過程中，HBx蛋白是一種多功能的調(diào)節(jié)蛋白，具有廣泛的反式激活功能，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展到侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著不可忽視的作用［5］，兩者是否對肝癌的生長和轉(zhuǎn)移具有協(xié)同作用尚不明確［6］。

葉下珠（PhyllanthusurinariaL）為大戟科葉下珠屬植物，含有生物堿類、多酚類等多種成分［7］，全草入藥，具有抗乙型肝炎病毒和抗腫瘤等作用［8］。目前從葉下珠中分離出沒食子酸、鞣花酸等多種化合物，其中多酚和可水解鞣質(zhì)為葉下珠的主要活性成分，沒食子酸的含量最高，沒食子酸是可水解鞣質(zhì)的單體，具有抗病毒、抗腫瘤［2，5］、抗血管生成［9］等作用，還有直接抗病毒作用［10］。而在目前研究中，尚無葉下珠對肝癌VEGFR3表達(dá)作用的相關(guān)報道。

此前，筆者以扶正祛邪為綱，擬定了復(fù)方葉下珠作為防治肝癌的協(xié)定方，并主要用于治療肝癌及癌前病變［11］，以及 HBxAg致肝癌的研究，證實復(fù)方葉下株可通過抑制HBxAg表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)［12］，阻止肝癌前病灶生長及肝癌的形成［13］，但兩者機(jī)制并不明確。在對葉下珠單體的研究中，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)兩種新的乙酰化黃酮苷化合物，可能發(fā)揮主要藥用價值［14］。

本研究中，各組動物體質(zhì)量均隨時間增長，實驗結(jié)束時，接種HepG2－HBx細(xì)胞的各組中，AEP組（G4）腫瘤質(zhì)量及HBx表達(dá)水平均較CTX組更低，也與前期結(jié)果一致［12］。按處理因素進(jìn)行分層，對接種細(xì)胞因素的效應(yīng)進(jìn)行多重比較，結(jié)果顯示，在接受NS處理的各移植瘤模型中，接種HepG2－HBx細(xì)胞和HepG2－VEGFR3細(xì)胞的裸鼠移植瘤組織中VEGFR3表達(dá)水平均顯著高于接種HepG2－CAT細(xì)胞組（P＜0.05），表明VEGFR3在接種 HepG2－HBx細(xì)胞和 HepG2－VEGFR3細(xì)胞的Balb／c裸鼠皮下移植瘤組織中均有較強(qiáng)表達(dá)，HBx可能上調(diào)肝癌細(xì)胞中VEGFR3表達(dá)水平。按接種細(xì)胞因素進(jìn)行分層，對于接種相同肝癌細(xì)胞的各組裸鼠，AEP處理組VEGFR3表達(dá)水平均顯著低于NS和CTX處理組，表明AEP具有較好的抑制肝癌細(xì)胞VEGFR3表達(dá)水平的作用。

綜上所述，AEP不僅對肝癌移植瘤中HBx表達(dá)具有直接抑制作用，同時也直接抑制肝癌移植瘤中VEGFR3蛋白表達(dá)，并可能通過抑制HBx蛋白表達(dá)間接抑制VEGFR3蛋白表達(dá)，實現(xiàn)對乙型肝炎相關(guān)性肝癌的抑制作用。同時，AEP對HBx陰性肝癌的抑制作用，可能也是通過VEGFR3途徑得以實現(xiàn)的。由于乙型肝炎相關(guān)肝癌的機(jī)制尚未完全明了，其攜帶HBx或VEGF及相關(guān)VEGFR的水平可能也與外源性轉(zhuǎn)染基因存在較大差異，因此，對其相關(guān)性尚有待進(jìn)一步探討和確認(rèn)。

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