反相高效液相色譜法測(cè)定醉魚(yú)草果實(shí)中木犀草素的含量

陳以軍，任亞碩，吳德玲，張 偉，汪天明

（1．六安市立醫(yī)院，安徽 六安 237001；2．現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230038；3．安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230038；安徽中醫(yī)藥大學(xué)科技處，安徽 合肥 230038）

醉魚(yú)草果實(shí)藥材是馬錢科植物醉魚(yú)草（BuddlejalindleyanaFort．）的果實(shí)，具有祛風(fēng)除濕、止咳化痰、散瘀之功效［1］。本課題組已從中發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了多種成分及其生物活性［2－5］，包括多種黃酮類成分，其中木犀草素作為一種常見(jiàn)黃酮，是其抗菌消炎作用的主要活性成分［6－7］，具有較強(qiáng)的抗炎抗氧化活性［8］。另外它還具有抗腫瘤、防治心血管疾病以及保護(hù)心肌細(xì)胞等多種藥理活性［9－11］。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，木犀草素廣泛存在于醉魚(yú)草屬植物中，前期系統(tǒng)分離實(shí)驗(yàn)也從醉魚(yú)草果實(shí)中分離得到木犀草素等多種黃酮類成分［4］，但醉魚(yú)草果實(shí)中木犀草素含量測(cè)定的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。故筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)［12－13］，采用反相高效液相色譜法建立了醉魚(yú)草果實(shí)中木犀草素含量的測(cè)定方法，以期為醉魚(yú)草這一傳統(tǒng)藥用資源的系統(tǒng)開(kāi)發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 高效液相色譜儀：美國(guó) Agilent 1260（二元泵：G1312C，柱溫箱：G1316A，DAD檢測(cè)器：G4212B，自動(dòng)進(jìn)樣器：G1329B）；AB135－S十萬(wàn)分之一分析天平：瑞士 METTLER TOLEDO；HH－S恒溫水浴鍋：江蘇金壇市國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；FZ－02型高速中藥粉碎機(jī)：浙江省溫嶺市百樂(lè)粉碎設(shè)備廠；AS3120超聲清洗儀：天津奧特塞恩斯；Milli－Q一體式超純水系統(tǒng)：德國(guó)默克密理博。

1．2 試藥 木犀草素：中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)111520－200504；醉魚(yú)草果實(shí)：2008年12月采自安徽舒城萬(wàn)佛山，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉守金教授鑒定為馬錢科植物醉魚(yú)草（BuddlejalindleyanaFort．）的果實(shí)；甲醇：色譜純；水：實(shí)驗(yàn)室自制超純水；其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Welch Ultimate AQ－C18柱（250mm×4．6mm，5μm），流動(dòng)相：甲醇－水－乙酸（60∶40∶2），流速：1ml／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：350nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μl。在本色譜條件下，木犀草素的理論塔板數(shù)大于3 000，其色譜峰與共存物質(zhì)色譜分離度大于1．5。木犀草素（對(duì)照品）及醉魚(yú)草果實(shí)（供試品）的高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品（A）與供試品（B）溶液的反相高效液相色譜圖

2．2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取在五氧化二磷減壓干燥器中干燥36h以后的木犀草素對(duì)照品2．16mg，加適量甲醇溶解，定容至100ml，即得濃度為21．6μg／ml的木犀草素對(duì)照品溶液。

2．3 供試品溶液的制備 精密稱取醉魚(yú)草果實(shí)粗粉1g，加甲醇20ml回流提取1h，提取3次，合并濾液，定容至100ml，用微孔濾膜（0．45μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2．4 方法學(xué)考察

2．4．1 線性關(guān)系考察：精密吸取“2．2”項(xiàng)下木犀草素對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣2、5、8、10、15、20μl，測(cè)定峰面積，以峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，木犀草素的進(jìn)樣量（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得木犀草素線性回歸方程為：y＝3 610．4x－5．22，r＝0．999 9。結(jié)果表明，木犀草素進(jìn)樣量在0．043 2～0．432 0μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2．4．2 精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液10μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄各次木犀草素的峰面積值，RSD＝0．33%。表明儀器精密度良好。

2．4．3 重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取醉魚(yú)草粗粉1g，同“2．3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，在擬定的色譜條件下，進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算木犀草素的平均含量為0．096%，RSD＝1．28%。表明重復(fù)性良好。

2．4．4 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12h測(cè)定，記錄木犀草素峰面積值，其RSD＝1．17%。表明樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2．4．5 加樣回收率試驗(yàn)：精密稱取已知含量的醉魚(yú)草果實(shí)粗粉1g，共6份，置50ml圓底燒瓶中，分別精密加入與藥材含量相當(dāng)?shù)哪鞠菟貙?duì)照品，然后按“2．3”項(xiàng)步驟的供試品溶液制備方法制備，測(cè)定。結(jié)果表明，所建立的分析方法準(zhǔn)確度良好。見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)

2．5 樣品含量測(cè)定 按“2．3”項(xiàng)下步驟操作，制備供試品溶液，按“2．1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)得供試品中木犀草素含量為0．093%、0．095%、0．096%，平均含量為0．095%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中采用二極管陣列檢測(cè)器，在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)供試品及對(duì)照品溶液進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果供試品溶液與對(duì)照品溶液木犀草素對(duì)應(yīng)峰的最大吸收波長(zhǎng)均為350nm，且基本無(wú)干擾，因此選擇350nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。流動(dòng)相采用甲醇－水系統(tǒng)，并加入一定比例的乙酸，抑制其拖尾現(xiàn)象，最終選定流動(dòng)相為甲醇－水－乙酸（60∶40∶2）。此時(shí)有良好的分離度，峰形尖銳，分析時(shí)間在25min以內(nèi)。確定測(cè)定條件之后，又對(duì)醉魚(yú)草果實(shí)樣品的提取溶劑進(jìn)行考察，分別選取水，不同濃度的乙醇、甲醇、乙酸乙酯等多種溶劑進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇回流提取時(shí)，測(cè)得木犀草素含量最高。

醉魚(yú)草為民間常用中草藥，但其果實(shí)研究屬于空白，不利于醉魚(yú)草資源的綜合開(kāi)發(fā)。本研究通過(guò)高效液相色譜法建立了醉魚(yú)草果實(shí)中木犀草素的含量測(cè)定方法，結(jié)果顯示該方法簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果可靠、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，為醉魚(yú)草果實(shí)中黃酮類成分的研究提供了參考依據(jù)。由醉魚(yú)草果實(shí)的高效液相色譜圖可知，木犀草素之前的色譜峰對(duì)應(yīng)成分含量較高，且極性比木犀草素大。由于本實(shí)驗(yàn)所選波長(zhǎng)主要是為了檢測(cè)黃酮類成分，故推測(cè)其對(duì)應(yīng)成分可能為黃酮苷類化合物。故本實(shí)驗(yàn)對(duì)醉魚(yú)草果實(shí)的系統(tǒng)分離工作也具有一定的指導(dǎo)意義。

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