黃蒲通竅膠囊對(duì)血管性癡呆大鼠行為學(xué)表現(xiàn)及海馬CA1區(qū)病理變化的影響

王 艷，謝道俊，鮑遠(yuǎn)程，張 娟，儲(chǔ)丹晨，韋 彪，孫愘叡，丁偉軍，鮑婷婷，王秋燁，趙志勇

（1.安徽省亳州市華佗中醫(yī)院腦病科，安徽 亳州 236800；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病科，安徽 合肥 230031；3.安徽省六安市中醫(yī)院腦病科，安徽 六安 237006）

血管性癡呆（vascular dementia，VaD）是指由缺血性卒中、出血性卒中等腦血管疾病導(dǎo)致的嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙綜合征［1］。隨著腦血管疾病發(fā)病率的提高，VaD的發(fā)病率也在迅速增加，近來有研究人員采用整體抽樣方法調(diào)查了上海市、黑龍江省、山西省和廣東省的城鄉(xiāng)社區(qū)60歲以上老年人，老年癡呆癥的患病率為5.2%［2］。VaD的主要表現(xiàn)有兩大方面：認(rèn)知功能障礙和相關(guān)腦血管病區(qū)的神經(jīng)功能障礙。VaD的臨床分類包括多梗死性癡呆、關(guān)鍵部位梗死性癡呆、皮質(zhì)下血管性癡呆和小血管性癡呆［3］。VaD不同于阿爾滋海默病，它是目前唯一可以防治的癡呆。本研究采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法復(fù)制VaD大鼠模型，并采用黃蒲通竅膠囊進(jìn)行治療，以觀察其對(duì)VaD大鼠行為學(xué)表現(xiàn)和海馬CA1區(qū)病理變化的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性健康Wistar大鼠90只，8周齡，清潔級(jí)，體質(zhì)量200～230g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2012－0002，適應(yīng)性喂養(yǎng)2周。

1.2 藥物 多奈哌齊：衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為國藥準(zhǔn)字H20050978；黃蒲通竅膠囊（由人參、大黃、石菖蒲、益智仁、川芎、郁金等組成）：安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科制備，批準(zhǔn)文號(hào)為皖藥制字Z20080006，生產(chǎn)批號(hào)為20120618。

1.3 儀器 Morris水迷宮及相關(guān)動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)：安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司。

2 方法

2.1 模型復(fù)制 采用永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈法［4］復(fù)制VaD大鼠模型。大鼠術(shù)前12h禁食，自由飲水。用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠仰臥，固定于自制的大鼠手術(shù)操作木板上，頸部皮膚剪毛備皮，碘伏常規(guī)無菌操作，酒精棉球脫碘。切口位于頸正中線處，長約1cm，鈍性分離皮下組織后，于切口正下方的斜方肌與氣管夾角處可見左側(cè)頸總動(dòng)脈搏動(dòng)，分離出左側(cè)頸總動(dòng)脈后，以4號(hào)絲線遠(yuǎn)近端雙重結(jié)扎，從中剪斷。右側(cè)操作方法與左側(cè)相同。術(shù)中動(dòng)作輕柔，避免鉗夾和過分牽拉迷走神經(jīng)，注意無菌原則，行逐層間斷縫合術(shù)，術(shù)后放入保溫的鼠籠（電熱毯保溫），待大鼠清醒后，放回動(dòng)物籠架上單籠飼養(yǎng)，予自由進(jìn)食進(jìn)水，術(shù)后連續(xù)5d每天以碘酒擦洗傷口及周圍皮膚。假手術(shù)對(duì)照組大鼠的雙側(cè)頸總動(dòng)脈不結(jié)扎，其余與模型組操作方法一致。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理 將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，隨機(jī)分為5組，即模型組、多奈哌齊組及黃蒲通竅組，各22只，假手術(shù)組及正常對(duì)照組各12只。術(shù)后24h各組予相應(yīng)藥物灌胃：正常組、假手術(shù)組及模型組：給予生理鹽水灌胃（每日5.0ml／kg）；多奈哌齊組：每日給予多奈哌齊溶液0.63mg／kg；黃蒲通竅組：每日給予黃蒲通竅溶液1.51g／kg，連續(xù)灌胃45d后，進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn)，觀察腦組織病理變化。

2.3 行為學(xué)檢測(cè) Morris水迷宮主要用于測(cè)試動(dòng)物對(duì)空間位置覺和方向覺（空間定位）的學(xué)習(xí)記憶能力，是檢測(cè)動(dòng)物記憶能力的重要工具［5］。Morris水迷宮可同步記錄大鼠逃避潛伏期、跨越平臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限次數(shù)、目標(biāo)象限距離等相關(guān)數(shù)據(jù)。本研究從術(shù)后第40天開始Morris水迷宮試驗(yàn)，設(shè)置最大潛伏時(shí)間為180s，實(shí)驗(yàn)分為兩部分［6］。①定位航行實(shí)驗(yàn)：用于訓(xùn)練和測(cè)量大鼠對(duì)水迷宮學(xué)習(xí)和記憶的能力。實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5d。第1天，水中不放平臺(tái)，上午將大鼠放入水中適應(yīng)游泳環(huán)境3min，最后將大鼠引至平臺(tái)上；下午記錄動(dòng)物游泳3min的軌跡，作為對(duì)照數(shù)據(jù)（圖1第1天下午數(shù)據(jù)）。從第2天開始，選一個(gè)象限放置平臺(tái)，每天分上午、下午分別從4個(gè)象限各選一個(gè)入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁分別從4個(gè)入水點(diǎn)放入水中，計(jì)算機(jī)自動(dòng)記錄大鼠從入水開始至尋找到平臺(tái)所需的時(shí)間，即為逃避潛伏期。從一個(gè)入水點(diǎn)放入水中至大鼠找到平臺(tái)為一個(gè)訓(xùn)練程序；如果大鼠3min內(nèi)未找到平臺(tái)，將其引至平臺(tái)，并停留40s，逃避潛伏期記為3min，每次訓(xùn)練間隔為1min，上午、下午各訓(xùn)練4個(gè)程序。②空間搜索實(shí)驗(yàn)：第6天，拆除平臺(tái)，然后選擇平臺(tái)所在的對(duì)角象限將大鼠面向池壁放入水中，系統(tǒng)自動(dòng)記錄：3min內(nèi)大鼠從對(duì)角象限跨躍原平臺(tái)的次數(shù)（簡(jiǎn)稱“跨越平臺(tái)次數(shù)”）及跨越平臺(tái)所在象限的次數(shù)（簡(jiǎn)稱“目標(biāo)象限次數(shù)”），3min內(nèi)游泳距離及其占游泳總距離的百分比（簡(jiǎn)稱“目標(biāo)象限距離”）。

2.4 病理學(xué)檢測(cè) 水迷宮實(shí)驗(yàn)后，將大鼠斷頭處死，在冰塊上取大鼠海馬，用4%多聚甲醛灌注固定后，取海馬CA1區(qū)包埋，連續(xù)冠狀切片，片厚5μm，用蘇木精－伊紅（hematoxylin－eosin，HE）染色，觀察海馬CA1的病理變化。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。連續(xù)型變量采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。同組大鼠逃避潛伏期比較，采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析；各組跨越平臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限次數(shù)、目標(biāo)象限距離比較，采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況 雙側(cè)頸總動(dòng)脈同時(shí)結(jié)扎術(shù)后，大鼠總體表現(xiàn)出活動(dòng)減少，稍有煩躁，攝食及飲水不積極，其中單瞼下垂50只，雙瞼下垂20只，單瞼出血21只，雙瞼出血15只，這些情況多在48h內(nèi)恢復(fù)正常，其中2只大鼠出現(xiàn)永久性偏癱，4只手術(shù)后出現(xiàn)癲癇發(fā)作（極度煩躁、抽搐等）并于24h內(nèi)死亡，3只出現(xiàn)聲音嘶啞，1只出現(xiàn)飲水嗆咳。在隨后實(shí)驗(yàn)過程中，2只大鼠出現(xiàn)傷口膿包，予以切開排膿處理，灌胃過程中死亡2只，不明原因死亡3只。結(jié)果共死亡37只（手術(shù)過程中死亡4只、術(shù)后24h死亡16只，術(shù)后24h至1周死亡10只，1周至行為學(xué)檢測(cè)期間死亡7只），礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn)排除焦慮、抑郁癥大鼠2只，排除永久性偏癱大鼠2只，結(jié)果共剩余49只大鼠完成本實(shí)驗(yàn)（正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組各9只，黃蒲通竅組12只，多奈哌齊組10只）。

3.2 Morris水迷宮結(jié)果比較

3.2.1 定位航行試驗(yàn)結(jié)果比較：從第2天開始，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長（P＜0.01）；各組逃避潛伏期隨著訓(xùn)練程序的增加而降低，至第4天和第5天趨于平穩(wěn)，此時(shí)黃蒲通竅組和多奈哌齊組大鼠逃避潛伏期均較模型組顯著縮短（P＜0.01），但仍顯著高于對(duì)照組及假手術(shù)組（P＜0.05）；多奈哌齊組和黃蒲通竅組大鼠逃避潛伏期比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖1。

3.2.2 各組空間探索試驗(yàn)結(jié)果比較：假手術(shù)組與正常對(duì)照組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限次數(shù)及目標(biāo)象限距離比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；模型組上述3個(gè)指標(biāo)均較假手術(shù)組顯著降低（P＜0.01）；黃蒲通竅組和多奈哌齊組上述3個(gè)指標(biāo)均較模型組顯著升高（P＜0.01）；黃蒲通竅組與多奈哌齊組上述3個(gè)指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

3.3 各組大鼠海馬CA1區(qū)病理變化比較 正常組和假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞多而排列緊密、均勻、整齊，層次清晰，胞體完整，胞漿豐富，胞核大而圓，核膜完整，核仁清晰，染色均勻。模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，大部分神經(jīng)細(xì)胞皺縮，排列紊亂，胞體形態(tài)各異，胞核著色較深，呈嗜酸性變，核固縮，核仁消失，胞漿周圍出現(xiàn)空暈，少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞明顯腫脹，神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與周圍的間隙明顯增寬。黃蒲通竅組大鼠海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較多，排列較密，層次較清晰，神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，胞核呈圓形或橢圓形，核仁清晰，染色質(zhì)豐富，少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞變性、萎縮、染色較深，神經(jīng)細(xì)胞周圍的間隙較模型組稍有增寬。多奈哌齊組大鼠海馬CA1區(qū)組織形態(tài)學(xué)變化與黃蒲通竅組類似。見圖2。

圖1 各組大鼠不同時(shí)間逃避潛伏期比較

表1 各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

表1 各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

正常對(duì)照9 9.01±1.23 12.90±2.57 83.42±9.85假手術(shù) 9 8.59±1.67 11.64±2.70 83.41±8.20模 型 9 3.82±2.22＊＊ 5.57±1.13＊＊24.31±4.09＊＊多奈哌齊 10 6.98±1.13＃＃12.42±3.69＃＃77.23±8.23＃＃黃蒲通竅 12 6.30±0.78＃＃11.20±2.86＃＃76.75±7.36＃＃

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)組織形態(tài)學(xué)變化比較（HE染色，10×40倍）

4 討論

目前，VaD模型的復(fù)制方法很多，雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法操作簡(jiǎn)單，應(yīng)用廣泛，很好地模擬了VaD慢性低灌注這一病理過程。雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法可導(dǎo)致海馬CA1區(qū)缺血。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VaD模型海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡、壞死嚴(yán)重，而黃蒲通竅組和多奈哌劑組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡、壞死明顯減輕。結(jié)果提示，VaD大鼠模型可很好地模擬慢性腦缺血致認(rèn)知障礙的病理改變，是觀察慢性低灌注導(dǎo)致腦白質(zhì)損害的有效工具；黃蒲通竅膠囊和多奈哌齊可以拮抗VaD大鼠認(rèn)知功能相關(guān)腦區(qū)的病理變化。本研究中，動(dòng)物模型的復(fù)制成功率較低（約為54.44%），大鼠死亡原因主要有4個(gè)方面。①雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后，出現(xiàn)急性腦缺血水腫，誘發(fā)癲癇。②手術(shù)切口雖然小，但術(shù)中因要?jiǎng)冸x頸總動(dòng)脈，牽拉損傷迷走神經(jīng)導(dǎo)致生命節(jié)律變化。③因給藥時(shí)間達(dá)45d，每天灌胃，可能損傷大鼠食管胃黏膜。④因術(shù)前24h禁食，加之手術(shù)應(yīng)激，有的大鼠可能術(shù)中出現(xiàn)低血糖、肺部感染、昏迷等。

Morris水迷宮廣泛應(yīng)用于研究空間學(xué)習(xí)記憶機(jī)制，是最常用的動(dòng)物神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目。經(jīng)Morris水迷宮訓(xùn)練后形成的記憶是一種空間參考記憶，其儲(chǔ)存與提取涉及邊緣系統(tǒng)、基底前腦、紋狀體、小腦和其他相關(guān)區(qū)域，其記憶過程屬于陳述性記憶，而臨床上癡呆患者大多是陳述性記憶首先受損。所以，從檢測(cè)的記憶屬性來看，Morris水迷宮試驗(yàn)可以用于篩選VaD的有效防治藥物［7－9］。VaD臨床病機(jī)特點(diǎn)以正虛為主，兼有虛實(shí)夾雜，單純實(shí)證較少見，證型有腎虛髓虧、肝腎陰虛、痰蒙清竅、瘀阻清竅、心肝火旺、心脾兩虛、氣虛血瘀等。黃蒲通竅膠囊是本課題組基于多年臨床實(shí)踐總結(jié)出來的治療VaD的院內(nèi)制劑，具有益氣補(bǔ)腎、豁痰開竅、活血通絡(luò)的功效。前期研究［10－11］表明，黃蒲通竅膠囊能夠上調(diào)腦缺血后腦組織c－fos表達(dá)水平，下調(diào)腦組織核因子－κB表達(dá)水平，保護(hù)腦組織，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，通過Fas信號(hào)通路抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡而起到改善記憶和認(rèn)知功能的作用。臨床研究［13－14］發(fā)現(xiàn)，黃蒲通竅膠囊可明顯改善VaD患者智能積分，提高VaD患者的血清生長抑素、精氨酸加壓素水平，降低血清一氧化氮、一氧化氮合酶的含量。本研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后45d，黃蒲通竅膠囊可以顯著拮抗VaD模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的下降。

綜上所述，雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎可引起模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降和海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷，黃蒲通竅膠囊能夠改善模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，并且能明顯改善大鼠海馬CA1區(qū)的病理變化。

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