行氣調(diào)神針刺療法對缺血性卒中后抑郁大鼠左前皮質及海馬CREB和PDE4mRNA表達的影響

崔倩倩，蔡圣朝，曹云燕，費愛華，朱才豐，徐 雯

（1.安徽中醫(yī)藥大學研究生部，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學附屬針灸醫(yī)院，安徽 合肥 230061）

卒中后抑郁（post stroke depression，PSD）是一種常見的腦血管病并發(fā)癥，表現(xiàn)為多種精神和軀體癥狀的復雜的情感精神障礙性疾病，既不同于一般抑郁癥，又不同于一般抑郁心情，通常被定義為“卒中后抑郁狀態(tài)”，臨床以情緒控制能力差和（或）肢體活動障礙為主要表現(xiàn)。腦卒中患者的抑郁狀態(tài)發(fā)生率較高，其患病率為30%～35%［1］。目前多數(shù)學者認為PSD與神經(jīng)遞質分泌異常有關，是病灶破壞了去甲腎上腺素能（noradrenergic，NE）和5－羥色胺（5－h(huán)ydroxytryptamine，5－HT））神經(jīng)細胞及其通路，使這兩種遞質低下而致抑郁［2］。臨床上目前多使用抗抑郁藥來控制PSD，但抗抑郁藥物有較多的不良反應。亦有相關的中藥可治療PSD［3－4］，但長期服用亦可致肝腎損害。針刺作為一種“綠色療法”正日益受到重視，大量臨床對照試驗證實針灸治療PSD有一定的療效［5］。前期臨床研究表明，針刺人中、雙側合谷、雙側太沖可治療PSD［6］。針刺治療PSD的基礎研究還不夠深入，其改善作用與cAMP反應元件結合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）mRNA 和磷酸二酯酶4（phosphodiesterase 4，PDE4）mRNA表達調(diào)節(jié)的關系有待于進一步研究。

CREB是一種選擇性結合cAMP反應元件的核蛋白，調(diào)控多種基因的表達。研究［7－8］表明CREB的磷酸化有利于治療相關血管疾病和具有保護神經(jīng)細胞的功能。另外，CREB具有調(diào)節(jié)多種復雜記憶方式的生物學功能，是長期記憶形成過程中重要的調(diào)制器［9］。特別是CREB可以參與阿片類物質依賴的形成［10］。

PDE具有水解細胞內(nèi)第二信使（cAMP和cGMP）的功能，從而終結其所傳導的生化作用。PDE4是PDE家族的成員之一，主要在神經(jīng)細胞和炎性細胞內(nèi)，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的功能有密切的關 系［11］。 研 究［12－13］表 明 PDE4 的 抑 制 劑 可治療老化相關疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。

本研究擬通過觀察行氣調(diào)神針刺療法（針刺人中，雙側合谷、雙側太沖）對PSD模型大鼠左前皮質及海馬CREB和PDE4mRNA表達的干預作用，初步闡明PSD的發(fā)病機制及行氣調(diào)神針刺療法的作用機制，為其治療PSD提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 健康雄性SD大鼠80只，8月齡，體質量（300±50）g，購于南京醫(yī)科大學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2008－0004。適應性喂養(yǎng)1周后行曠野實驗行為評分，將水平運動和垂直運動總分低于30分或高于120分的動物予以剔除。

1.2 藥品及試劑 Trizol試劑：Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒和PCR試劑：美國Thermo公司；瓊脂糖凝膠：上?；蚬?；DNA Marker：寶生物工程（大連）有限公司；溴化乙錠：美國Sigma公司；鹽酸氟西汀膠囊：禮來蘇州制藥有限公司，國藥準字J20080016。

1.3 主要儀器 PCR儀（S1000）、凝膠成像系統(tǒng)（GelDoc）和水平凝膠電泳系統(tǒng)：Bio－Rad公司；冷凍離心機（5417R）：德國Eppendorf公司；紫外觀察燈：美國SIM公司；TPM－900型 Morris水迷宮：北京友誠嘉業(yè)生物科技有限公司；HZQ－C空氣振蕩儀：黑龍江省哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；HPX－9052 MBE型數(shù)顯電熱恒溫箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠。

2 方法

2.1 動物分組 80只大鼠按隨機數(shù)字法分組，20只作為正常組，其余60只用于復制腦缺血模型。1周后行Zea Longa神經(jīng)行為學評分以判斷腦缺血模型是否復制成功，結果51只大鼠模型復制成功，7只大鼠死亡，2只大鼠模型復制不成功。隨機將模型復制成功的動物分為模型組、針刺組（行氣調(diào)神針刺療法）、西藥組（鹽酸氟西汀治療），每組17只，在PSD模型復制及治療期間均有大鼠死亡，最后每組用于檢測的大鼠均為11只。實驗過程嚴格遵循2006年國家科技部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》的相關規(guī)定。

2.2 PSD模型復制 通過電凝大鼠大腦中動脈引起局部腦缺血［14］結合改良 Willner P等［15］方法（慢性應激＋孤養(yǎng)法）復制PSD模型。①腦缺血模型復制。10%水合氯醛（4ml／kg）腹腔麻醉，在顳骨前下緊鄰顴弓前份上緣部位開窗，暴露0.5cm×0.5cm的骨窗。凝閉位于嗅束至大腦下靜脈之間的大腦中動脈主干及周圍小動脈分支。②慢性應激＋孤養(yǎng)法。大鼠在3周內(nèi)安排7種應激方法，每天隨機選取一種應激方法。正常組除第1天、第8天、第15天禁水，次日進行蔗糖水試驗外，均正常進食、飲水。模型組、針刺組、西藥組單籠飼養(yǎng)，開始21d的慢性應激，包括3次24h禁水，3次24h禁食，3次通宵照明，3次4℃冰水游泳5min，3次45℃恒溫箱熱烘5min，3次夾尾1min，3次30min高速水平振蕩（160次／min），每種應激方法每周1次，隨機選取。應激結束后繼予以單籠飼養(yǎng)16d。

2.3 PSD模型檢測 通過蔗糖水消耗量（測試動物對獎賞的欣快反應）、敞箱測定（垂直活動反映大鼠的興趣高低，水平活動反映大鼠的運動活動性水平）和水迷宮測定（定位航行試驗反映大鼠的學習能力情況，空間探索試驗反映大鼠的空間記憶能力），在慢性應激的第1天和治療的第21天，以及治療6周結束后進行神經(jīng)行為學評分。評分標準參考Zea Longa等［15］制定的6級評分法：無功能障礙為0分；不能伸展前肢為1分；向一側旋轉為2分；向一側傾倒為3分；無自主活動伴意識抑制為4分；死亡為5分。評分為1～4分即模型復制成功。

2.4 治療方法

2.4.1 針刺組：慢性應激的第8天開始，針刺SD大鼠的“人中”、雙側“合谷”、雙側“太沖”，取穴標準參照《實驗針灸學》［16］，大鼠針刺后置于鼠架上留針15min，期間以捻轉手法行針1次，每日1次，14d為1個療程，療程間隔1d，共3個療程。

2.4.2 西藥組：慢性應激的第8天開始，予0.231 g／ml氟西汀混懸液10ml／kg（即2.31mg／kg，相當于成人臨床用量的7倍）灌胃治療，每日1次，療程與針刺組相同。

2.4.3 模型組和正常組：應激第8天開始，予以生理鹽水10ml／kg灌胃，每日1次。

2.5 指標檢測方法 治療結束后，將大鼠斷頭取腦，置于冰面上分離左前皮質及左側海馬，放于－70℃冰箱備用。RT－PCR實驗：根據(jù)文獻確定β－actin、CREB及PDE4mRNA的PCR引物序列（見表1），引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。用Trizol一步法提取各組大鼠左前皮質與海馬總mRNA，紫外分光光度計定量mRNA純度較好。反應總體積20μl，含PCR混合物10μl，RT樣品2μl，無RNA酶水6.4μl，上游引物、下游引物各0.8μl。逆轉錄42℃，60min，70℃，5min；開始 PCR 循環(huán)：變性94℃，30s，退火52℃，30s，延伸72℃，45s，共35個循環(huán)，最后1個循環(huán)于72℃繼續(xù)反應10min。取5μl PCR產(chǎn)物上樣于2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，20min后采用凝膠成像系統(tǒng)觀察結果并進行拍照。

表1 β－actin、CREB及PDE4mRNA引物序列

2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學分析。連續(xù)型變量采用“均數(shù)±標準差（±s）”進行統(tǒng)計學描述。各組間均數(shù)比較，采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

與正常組比較，模型組大鼠皮質及海馬部位的CREB mRNA表達水平顯著下調(diào)（P＜0.01），PDE4 mRNA表達水平顯著上調(diào)（P＜0.01）；與模型組比較，西藥及針刺組大鼠左前皮質及海馬CREB mRNA表達水平明顯上調(diào)（P＜0.01），PDE4mRNA表達水平明顯下調(diào)（P＜0.01）。見表2、圖1。

表2 各組大鼠左前皮質及海馬CREB和PDE4mRNA表達水平比較（±s）

表2 各組大鼠左前皮質及海馬CREB和PDE4mRNA表達水平比較（±s）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與西藥組比較，△△P＜0.01。

正常 11 1.040±0.019 0.697±0.012 0.263±0.010 0.382±0.012模型 11 0.587±0.022＊＊ 0.498±0.014＊＊ 0.774±0.026＊＊ 0.682±0.024＊＊西藥 11 0.852±0.012＃＃ 0.743±0.014＃＃ 0.371±0.013＃＃ 0.412±0.012＃＃針刺11 0.865±0.024＃＃0.726±0.014＃?！鳌?.275±0.013＃?！鳌?.416±0.016＃＃

圖1 各組大鼠CREB、PDE4表達水平比較（RT－PCR法）

4 討論

PSD屬于中醫(yī)學中風后“郁證”范疇。中醫(yī)學對此早已有較多的認識，例如《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有較多關于情志致郁的論述，至明代《醫(yī)學正傳》首先采用“郁證”這一病名。自此之后，已逐漸把情志之郁作為“郁證”的主要內(nèi)容。PSD的發(fā)病機制尚不十分明確，目前多認為其發(fā)病機制與神經(jīng)遞質分泌異常有關，多種環(huán)境因素及認知障礙、軀體功能障礙等生物因素的疊加作用也促使PSD的發(fā)生，而腦損傷的部位與PSD的發(fā)生也有密切的關系［17］。有研究認為成纖維細胞生長因子－2表達水平下降也是引起PSD的原因之一［18］。目前抑郁癥的生化機制研究已從神經(jīng)遞質及其受體轉移到信號傳導通路上，現(xiàn)多集中在抑郁癥患者的G蛋白變化及相關的信號傳導通路方面，而目前G蛋白介導的信息傳導通路的研究熱點是環(huán)磷酸腺苷通路和磷脂酰肌醇通路。本研究主要從cAMP通路入手觀察行氣調(diào)神針法治療PSD的機制。

腦卒中可導致臟腑虛弱、情志內(nèi)傷、肝氣郁結，久則血瘀、痰濁等實邪內(nèi)生，導致氣機逆亂，擾及腦神、心神，致使腦失所控、神明失用。除了出現(xiàn)肢體活動障礙癥狀外，亦有精神恍惚、心神不寧、悲憂善哭、喜怒無常、失眠健忘等郁證表現(xiàn)［19］。本課題組通過長期臨床總結，提出氣機失調(diào)、腦神失控為PSD的主要病機，確立行氣調(diào)神針法為PSD的治療大法。

本針刺療法選用合谷（雙）、太沖（雙）、人中。合谷為手陽明大腸經(jīng)原穴，陽明經(jīng)為多氣多血之經(jīng)，該穴具有調(diào)和氣血、行氣開竅、通降氣機之效。太沖為足厥陰肝經(jīng)原穴，有通經(jīng)活絡、舒肝理氣、平肝熄風之效?！鹅`樞·九針十二原》云：“五臟有疾，當取之十二原。”《席弘賦》亦云：“手連肩脊痛難忍，合谷針時要太沖?！焙瞎?、太沖并用，即“開四關”。合谷屬陽，主氣，太沖屬陰，主血；二穴相配，一陰一陽，可調(diào)節(jié)人體氣血陰陽的升降平衡。研究認為針刺雙側合谷和太沖可激活腦部多個區(qū)域，且并非是單獨針刺兩穴所激活腦區(qū)的簡單疊加［20］。人中穴為督脈經(jīng)穴，亦為手足陽明經(jīng)和督脈的交會穴，具有開竅醒神和安神定志的作用。太沖、合谷、人中三穴合用，共奏行氣調(diào)神之效。

PDE4作為cAMP的特異性水解酶，可以在不同的時間和空間調(diào)節(jié)cAMP濃度，對cAMP介導的信號反應區(qū)域化起重要的作用。而作為胞內(nèi)第二信使的cAMP，是由cAMP信號通路上腺苷酸環(huán)化酶催化ATP生成，其具有調(diào)節(jié)細胞代謝生長和分裂、記憶形成、神經(jīng)傳遞、基因表達等作用。另外cAMP可激活蛋白激酶A和蛋白激酶C亞基進入核內(nèi)，使CREB轉錄因子特異的絲氨酸殘端磷酸化而活化，磷酸化的CREB可以與cAMP反應元件結合，從而調(diào)節(jié)基因的轉錄。這些基因的一些蛋白質產(chǎn)物對學習記憶是必不可少的，因此在學習記憶中cAMP有非常重要的作用。因此通過抑制PDE4來增加cAMP的含量，促使CREB磷酸化，進而促進神經(jīng)再生和神經(jīng)細胞修復而發(fā)揮抗抑郁作用。

本研究結果顯示，PSD大鼠左前皮質及海馬CREB mRNA的表達顯著減少，PDE4mRNA的表達顯著高于其他各組；行氣調(diào)神針刺療法和鹽酸氟西汀膠囊具有調(diào)節(jié)PSD大鼠左前皮質及海馬CREB mRNA和PDE4mRNA表達的作用。本研究結果可為行氣調(diào)神針刺療法替代抗抑郁藥物治療PSD提供實驗依據(jù)。

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