維通靜脈注射乳劑制備工藝研究＊

王成蹊 ，秦 飛 ，周 靜 ，周 毅 ，李 磊 ，毛 萍 ，侯連兵

(1．廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院，廣東 廣州 510006;2．南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510515;3．內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110;4．廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510182)

維通注射液是南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)部在驗(yàn)方常通口服液的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的用于防治盆腹腔術(shù)后粘連的復(fù)方中藥注射劑，主要由丹參、大黃等中藥組方，具有益氣養(yǎng)血、理氣化瘀的的功效。試驗(yàn)證明，維通注射液可防治大鼠手術(shù)后腹腔粘連，顯著降低大鼠術(shù)后盲腸組織內(nèi)羥脯氨酸含量[1]，亦可降低手術(shù)后兔體內(nèi)羥脯氨酸與纖維蛋白原含量，病理切片表明其可抗炎、改善纖維化、修復(fù)創(chuàng)傷組織[2]。前期試驗(yàn)測(cè)得維通注射液的半數(shù)致死量為8．4 mg/kg，注射此劑小鼠會(huì)出現(xiàn)一系列中毒現(xiàn)象[3]。為進(jìn)一步降低毒性并解決藥物中部分脂溶性成分難溶的情況，本試驗(yàn)采用二步乳化法制備了維通靜脈注射乳劑(WIE)，并采用溶血試驗(yàn)研究其安全性。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

Platisil ODS色譜柱(美國(guó)Dikma公司);CTO－20A型高效液相色譜儀(日本島津公司);Nano ZS90型馬爾文激光粒度儀(英國(guó)馬爾文儀器有限公司);FA25型高剪切分散乳化機(jī)(德國(guó)FLUKO公司);M－110EH型高壓均質(zhì)機(jī)(美國(guó)Microfluidics公司)。注射用大豆油(廣州漢方現(xiàn)代中藥研究開(kāi)發(fā)有限公司);中鏈甘油三酯、注射用蛋黃卵磷脂、注射用油酸均購(gòu)自德國(guó)Lipoid公司;注射用甘油(汕頭古漢紫光氨基酸有限公司);甲醇、乙腈(美國(guó)Fisher Scientific公司)，其余試劑均為分析純。新西蘭家兔(南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

2 方法與結(jié)果

2．1 乳劑制備

經(jīng)過(guò)預(yù)試驗(yàn)初步得到靜脈注射乳劑制備方法，將脂溶性組分分散于混合油相(含MCT10g、大豆油10g)中，加入油酸、維生素E，60℃磁力攪拌溶解，制得油相。稱取水溶性組分、蛋黃卵磷脂、甘油，分散于60 mL水相(注射用水)中，60℃攪拌溶解，制得水相。于60℃高速(9 500 r/min)剪切攪拌，將油相緩慢滴加入水相中，共剪切約10 min，用注射用水稀釋定容至100 mL，制得初乳。25℃下轉(zhuǎn)移至高壓均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)。裝瓶，充氮，密封，105℃水浴滅菌30 min，冰水浴迅速降溫，即得WIE。

2．2 組方優(yōu)化

由于維通注射液由脂溶性和水溶性2種藥物構(gòu)成，2種藥物會(huì)分別溶解于靜脈乳的油相和水相，因此有必要對(duì)不同油相、不同乳化劑、不同穩(wěn)定劑進(jìn)行正交試驗(yàn)，觀察在不同條件下乳劑的穩(wěn)定性，尋找有利于2種藥物穩(wěn)定溶解的最佳處方。在初步固定工藝的基礎(chǔ)上將油相、卵磷脂、油酸的用量這3個(gè)因素作為考察對(duì)象，每個(gè)因素選3個(gè)水平，采用 L9(34)正交試驗(yàn)，制備不同批次乳劑，以乳劑在80℃的穩(wěn)定時(shí)間 K作為處方穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究處方的最佳配比。結(jié)果最佳處方組成為油相20%，卵磷脂 1．0%，油酸 0．06% 。

2．3 制備工藝優(yōu)化

2．3．1 滅菌條件考察

在確定靜脈注射乳劑處方基礎(chǔ)上，取同一批靜脈注射乳劑分成3組，每組分裝3只西林瓶，充氮?dú)?，按不同條件消毒，研究WIE在不同高壓滅菌方法下的耐熱性。試驗(yàn)使用的3種條件分別為105℃高壓滅菌30 min，115℃高壓滅菌25 min，121℃高壓滅菌20 min。滅菌后觀察靜脈注射乳劑性狀，結(jié)果見(jiàn)表3?？梢?jiàn)，其中115℃高壓滅菌25 min和121℃高壓滅菌20 min均發(fā)生破乳分層現(xiàn)象，105℃高壓滅菌30 min未見(jiàn)破乳，滅菌效果最好。因此，滅菌條件選擇為105℃高壓滅菌30 min。

2．3．2 熱壓滅菌對(duì)pH的影響

由于磷脂遇熱易水解產(chǎn)生脂肪酸而降低靜脈注射乳劑的pH，影響其穩(wěn)定性及包封率，故需考察熱壓滅菌對(duì)制劑pH的影響。按照試驗(yàn)優(yōu)選后的處方配置靜脈注射乳劑，任取1個(gè)樣品，測(cè)定其粒徑為200．2 nm，分別裝到5個(gè)西林瓶?jī)?nèi)，用氫氧化鈉和鹽酸溶液分別調(diào)節(jié)制劑的 pH 至 6．0，7．0，8．0，9．0，10．0，并 105 ℃滅菌30 min，考察滅菌前后乳劑的pH、外觀變化。結(jié)果見(jiàn)表1。由于pH經(jīng)高壓滅菌后會(huì)降低，因此在制得脂肪乳后應(yīng)先將其pH調(diào)整至9．0，再滅菌。pH為6．2的乳劑滅菌后發(fā)生破乳現(xiàn)象，故無(wú)法測(cè)量。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 熱壓滅菌對(duì)乳劑pH的影響

2．3．3 不同均質(zhì)壓力和次數(shù)對(duì)乳劑的影響

按處方(0．002%DA，0．02%DB，20% 油相，0．06% 油酸，0．5%維生素E，2．5%甘油)制備初乳后，將初乳分成3批，各600 mL，3批分別在5 000 psi，10 000 psi和20 000 psi壓力下用高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)乳化，并在均質(zhì)乳化第 1，2，3，4，6，8，12，16 次留樣，測(cè)定樣品粒徑并觀察樣品性狀。結(jié)果樣品性狀均為白色乳狀液體，無(wú)油花，粒徑見(jiàn)表2?？梢?jiàn)，隨著均質(zhì)次數(shù)的增加，靜脈注射乳劑的粒徑逐漸減小，最后趨向于一個(gè)恒定值，一般情況下均質(zhì)3～4次后粒徑大小和該值相差不大。但當(dāng)使用不同壓力時(shí)，該恒定值也存在較大差異，故需在正交試驗(yàn)中尋找最佳成乳壓力。

表2 不同均質(zhì)壓力和次數(shù)對(duì)乳劑粒徑的影響(nm)

2．3．4 制備工藝條件優(yōu)化

脂肪乳劑質(zhì)量的好壞主要與乳化技術(shù)工藝有關(guān)。根據(jù)文獻(xiàn)[5]對(duì)脂肪乳注射液生產(chǎn)的經(jīng)驗(yàn)，列出制備工藝中對(duì)脂肪乳質(zhì)量可能影響較大的各個(gè)因素和水平，選擇混合溫度、混合時(shí)間、均質(zhì)壓力作為影響因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)，以乳劑在80℃的穩(wěn)定時(shí)間K作為處方穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指標(biāo)，計(jì)算結(jié)果。得最佳工藝組成為混合溫度為60℃，混合時(shí)間為10 min，均質(zhì)壓力為20 000 psi。

2．4 理化性質(zhì)考察

2．4．1 亞微乳的粒徑、ζ－電位、黏度測(cè)定

精密量取3批維通靜脈注射乳劑樣品各0．5 mL，以注射用水稀釋定容至20 mL，使用粒度分布分析儀分別測(cè)定粒徑和ζ－電位，結(jié)果平均粒徑為(191．03±2．81)nm，平均 ζ－電位為(－38．83±2．40)mV，另精密量取3批維通靜脈注射乳劑樣品，使用黏度計(jì)測(cè)得平均黏度為(1．85 ±0．02)mPa·s。

2．4．2 維通靜脈注射乳劑中有效成分含量測(cè)定

由于WIE成分較多，本試驗(yàn)選擇丹參中具有代表性的藥物丹參酮ⅡA作為含量測(cè)定指標(biāo)。

色譜條件與方法學(xué)考察結(jié)果:色譜柱為C18柱;流動(dòng)相為甲醇－水(85∶15);流速為1．0 mL/min;柱溫為30℃;進(jìn)樣量為20 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。線性回歸方程為 Y=0．000 012 73X+0．012 698，R2=0．999 944 8，精密度的 RSD 為 0．13% 。

含量測(cè)定:取 500 μL(含 DA 10 μg)WIE 于試管中，加入0．1 mol/L NaOH 200 μL，并加入氯仿 1 000 μL，渦旋振蕩 5 min，40℃避光超聲20 min，繼續(xù)渦旋混合5 min，15 000 r/min離心10 min，液體分3層，上層為上清液，中間層為磷脂層，下層為氯仿層(呈淡紅色)，取下層氯仿液，置減壓干燥箱40℃干燥，殘?jiān)尤? mL甲醇溶解，定容，用0．45 μm濾膜過(guò)濾，于270 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)樣品含量。色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果吸收峰面積 A=770 408，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得丹參酮ⅡA含量為98．2%，證明制劑質(zhì)量良好。

圖1 維通靜脈注射乳劑丹參酮ⅡA高效液相色譜圖

2．5 體外溶血試驗(yàn)

取家兔血，5 mL置抗凝離心管中，放入裝載小玻璃珠的潔凈錐形瓶中振搖10 min，以除去纖維蛋白原，離心之后棄上清液，將紅細(xì)胞層用0．9%氯化鈉注射液沖洗4次，每次10 mL，每次沖洗后3 000 r/min離心20 min，除去上清液，直至上清液不呈紅色為止，然后吸取一定量紅細(xì)胞，用0．9%氯化鈉注射液按體積比稀釋制備2%紅細(xì)胞混懸液，4℃冰箱中冷藏備用。

取7支試管，編號(hào)為1～7，溶血試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表3，分別在各管內(nèi)加入適量2%紅細(xì)胞混懸液和0．9%氯化鈉注射液(7號(hào)管內(nèi)加蒸餾水做陽(yáng)性對(duì)照)，置37℃恒溫水浴中30 min后又分別加入不同量的WIE(6號(hào)管做陰性空白對(duì)照)，輕搖至均勻后放回37 ℃恒溫水浴中，分別于 0．5，1，2，3，4 h 時(shí)觀察試管內(nèi)紅細(xì)胞溶血情況。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將各試管以2 500 r/min的速率離心10 min后，分別取上清液在550 nm波長(zhǎng)處比色，以0．9%氯化鈉注射液管上清液為空白，蒸餾水管上清液作為100%溶血，計(jì)算各試管的溶血率[4]。結(jié)果見(jiàn)表4?？梢?jiàn)，在各時(shí)間點(diǎn)1～6管均未發(fā)生明顯溶血現(xiàn)象，說(shuō)明WIE組與陰性對(duì)照組無(wú)溶血現(xiàn)象;7號(hào)管在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均發(fā)生溶血現(xiàn)象。離心后比色得到溶血率在0．09%～1．22%之間，符合衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中溶血率不得超過(guò)5%的規(guī)定。因此，本試驗(yàn)制備的WIE滲透壓在安全范圍內(nèi)，且不含溶血成分，作為注射劑可以安全使用。

表3 維通靜脈注射乳劑溶血試驗(yàn)設(shè)計(jì)(mL)

3 討論

脂肪乳注射液是以植物油(主要成分為脂肪酸三酰甘油)為油相，輔以磷脂為乳化劑、等滲劑和注射用水乳化制得的水包油(O/W)型乳劑，是一種以脂肪油為軟基質(zhì)而被磷脂膜包封的微粒體分散系[5]。本試驗(yàn)制備的靜脈乳即為注射用脂肪乳，與其他微粒制劑相比較，載藥脂肪乳注射液具有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn):將藥物包裹于內(nèi)相或界面層中，包封率高，提高藥物穩(wěn)定性并降低藥物刺激性和毒性;能夠耐受終端高壓蒸汽滅菌，保證了制劑的安全性;載藥量高，確保了藥物的療效[5]。

表4 維通靜脈注射乳劑溶血試驗(yàn)結(jié)果

中藥?kù)o脈注射乳劑已有數(shù)個(gè)相應(yīng)產(chǎn)品上市。如鴉膽子油亞微乳注射劑[6]、薏苡仁油亞微乳注射劑、大蒜油亞微乳等[7－8]。本試驗(yàn)使用的藥物維通靜脈注射乳劑的主藥來(lái)自于丹參、大黃等植物提取物，其中部分組分具有脂溶性強(qiáng)而水溶性弱的性質(zhì)，無(wú)法直接溶解于水制備注射液，故采用先將脂溶性組分溶解于油相，再將水溶性組分溶解于水相后，制備靜脈注射乳劑。通過(guò)正交試驗(yàn)等，分別對(duì)處方和工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得生產(chǎn)乳劑的最佳條件。作者用超速離心法測(cè)定出藥物在油相中的含量為98．2%，表明制劑符合試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求。

采用紫外分光光度法測(cè)定溶血度準(zhǔn)確、快速且重現(xiàn)性好，彌補(bǔ)了試管法判斷誤差較大之不足。試驗(yàn)表明，WIE與體積分?jǐn)?shù)為2%的兔紅細(xì)胞混懸液于37℃孵育4 h不發(fā)生溶血現(xiàn)象，說(shuō)明制劑較為安全。

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