反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定皮膚墨水中間苯二酚和苯酚含量＊

王曉青，劉皈陽，馬建麗，吳海偉，賈燕花，徐超斗

(1．中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院藥劑藥理科，北京 100048;2．中國人民解放軍總后勤部衛(wèi)生部藥品儀器檢驗(yàn)所，北京 100071)

皮膚墨水是《中國醫(yī)院制劑規(guī)范》中收載的品種，臨床用于皮膚劃線，指示病灶范圍，便于治療[1]。目前，該品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚未建立含量測(cè)定項(xiàng)，與制劑的質(zhì)量控制要求不符。為了更好地控制制劑質(zhì)量，保障臨床用藥安全，筆者建立了同時(shí)測(cè)定該制劑中主要成分間苯二酚和苯酚含量的反相高效液相色譜(RP－HPLC)法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司);Mettler AE240型電子天平(美國梅特勒－托力多公司)。間苯二酚對(duì)照品(批號(hào)為100389－201202，含量為100．0%)、苯酚對(duì)照品(批號(hào)為100509－201203，含量為100．0%)均購自中國食品藥品檢定研究院;皮膚墨水(長(zhǎng)海醫(yī)院1批，批號(hào)為130628;解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院2批，批號(hào)為131106，131111);甲醇(色譜純，F(xiàn)isher公司);水為三蒸水。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱:Agilent zorbax SB －C18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇－水(40∶60);流速:1．0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):270 nm;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:室溫。

2．2 溶液制備

精密稱取間苯二酚對(duì)照品36．2 mg、苯酚對(duì)照品17．1 mg，分別置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得含間苯二酚724 μg/mL、苯酚342 μg/mL的對(duì)照品貯備液;再分別精密量取上述貯備液各2．5 mL，置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，制得每 1 mL 含間苯二酚 36．2 μg、苯酚 17．1 μg 的混合對(duì)照品溶液。精密量取皮膚墨水樣品0．5 mL，置50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，得供試品貯備液;精密量取供試品貯備液2．5 mL，置50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。按樣品處方及配制工藝，制備不含苯酚、間苯二酚的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn):分別取2．2項(xiàng)下3種溶液，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果見圖1?？梢姡┰嚻啡芤号c對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處有相應(yīng)的色譜峰，且供試品各組分峰的理論板數(shù)均在5 000以上，分離度大于1．5，處方中其他組分對(duì)間苯二酚和苯酚的測(cè)定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:分別精密量取含間苯二酚724 μg/mL、苯酚342 μg/mL 的對(duì)照品貯備液 1．5，2．0，2．5，3．0，3．5，4．0 mL 置50 mL容量瓶中，加入流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，得不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度(X)對(duì)峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，間苯二酚為Y1=7．579 X1+1．789 5(r=0．999 8)，苯酚為 Y2=8．605 X1+1．476 7(r=0．999 9)。結(jié)果表明，間苯二酚和苯酚質(zhì)量濃度分別在 21．6～57．6 和 10．3 ～27．4 μg/mL 范圍內(nèi)與各自峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):取每 1 mL 含間苯二酚 36．2 μg、苯酚 17．1 μg的混合對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果間苯二酚和苯酚的 RSD分別為0．07%和0．10%(n=6)，表明進(jìn)樣精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批樣品(批號(hào)為131106)5份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果間苯二酚和苯酚的含量分別為標(biāo)示量的100．41%和100．27%，RSD 分別為 0．60% 和 0．50%(n=5)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，按擬訂色譜條件分別于0，2，4，8，12，18，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果間苯二酚和苯酚峰面積的 RSD分別為0．38%和0．35%(n=7)，表明間苯二酚、苯酚在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn):精密量取9份已知含量的樣品溶液(批號(hào)為131106)，依法制備供試品貯備液，取供試品貯備液各2．5 mL，置100 mL容量瓶中，再分別精密加入含間苯二酚724 μg/mL、苯酚342 μg/mL 的對(duì)照品溶液 1．5，2．5，3．5 mL，按供試品溶液制備方法制備溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 間苯二酚及苯酚回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2．4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算間苯二酚和苯酚含量。結(jié)果見表2。

3 討論

間苯二酚、苯酚結(jié)構(gòu)相似，紫外吸收特性相近，故可采用HPLC法同時(shí)測(cè)定兩者的含量。取間苯二酚、苯酚對(duì)照品溶液在220～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，間苯二酚結(jié)果為275 nm，苯酚為271 nm，參考文獻(xiàn)[2－4]，選擇270 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

試驗(yàn)中比較了在甲醇和水在不同比例的條件下，各組分的峰形和分離情況，最后確定采用甲醇－水(40∶60)為流動(dòng)相。在此流動(dòng)相條件下，各組分的峰形及分離度均理想，未見其他組分干擾。

在確定含量檢測(cè)方法后，又對(duì)方法的耐用性進(jìn)行了考察。改變流速(±0．2 mL/min)、流動(dòng)相比例(±2%)，更換色譜柱(Eclipse XDB －C18柱、Eclipse plus－C18柱)，對(duì)樣品含量測(cè)定的影響均較小，RSD均小于2%，表明方法耐用性良好。方法學(xué)考察結(jié)果表明，所建立的含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于控制該制劑的質(zhì)量。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局．中國醫(yī)院制劑規(guī)范(西藥制劑第二版)[M]．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，1995:17．

[2]范 菲，劉鵬鳴，李鋒武，等．HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方水楊酸溶液中四組分的含量[J]．藥物分析雜志，2011，31(11):2 185－2 187．

[3]周蓓瀛，李 楠，張鋼平，等．高效液相色譜法測(cè)定水楊酸醇溶液中水楊酸含量[J]．中國藥業(yè)，2009，18(16):38－39．

[4]崔 麗．RP－HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方間苯二酚洗劑中間苯二酚和苯酚的含量[J]．中國藥房，2011，22(21):2 000 －2 001．