響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取豹皮樟多酚工藝

張宇思，王成章，2* ，舒阿慶，葉建中

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所;生物質(zhì)化學(xué)利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室;國(guó)家林業(yè)局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)室;江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210042;2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所，北京 100091;3.寧國(guó)市億邦生物科技有限公司，安徽 寧國(guó) 242300)

豹皮樟(Litsea coreana var.sinensis(Allen)Yang et H.P.Huang)是樟科木姜子屬植物，分布于安徽、浙江、四川、貴州、云南等地［1］。豹皮樟鮮葉經(jīng)加工后可作為一種植物代用茶，俗稱(chēng)老鷹茶、白茶，為我國(guó)南方民間長(zhǎng)期飲用，具有解毒消腫、明目益思、生津止渴、解表防暑的功效，是一種無(wú)毒副作用、無(wú)污染、風(fēng)味較佳的純天然野生飲品［2］。研究表明，豹皮樟中含有多種人體所需的氨基酸、礦物元素、維生素［3］，還含有黃酮類(lèi)、多酚類(lèi)、皂苷等多種生物活性成分，具有抗氧化、降血糖、降血脂、保肝護(hù)肝、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等作用［4］。目前關(guān)于豹皮樟活性成分的研究報(bào)道主要集中在黃酮類(lèi)、皂苷、揮發(fā)油上［5-7］，對(duì)豹皮樟多酚的研究報(bào)道較少。植物多酚也稱(chēng)單寧，是一類(lèi)廣泛存在于植物體內(nèi)的天然大分子化合物，對(duì)人的營(yíng)養(yǎng)和健康有著重要的影響，隨著研究的深入，植物多酚在醫(yī)學(xué)、食品、制革工業(yè)、日用化工等方面都表現(xiàn)出了越來(lái)越重要的作用［8］。超聲波提取方法由于操作簡(jiǎn)單快捷，提取率高，提取溫度低，提取物的結(jié)構(gòu)不易被破壞等特點(diǎn)，在熱敏成分的提取中有明顯的優(yōu)勢(shì)，已被廣泛用于植物多酚的提?。?-10］。響應(yīng)面法作為一種現(xiàn)代試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化方法，優(yōu)于線性回歸分析和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，可在給定范圍內(nèi)找到影響因素與響應(yīng)值之間明確的函數(shù)表達(dá)式，找到最佳的因素組合和最優(yōu)響應(yīng)值，目前已成為降低成本、優(yōu)化加工條件的一種有效方法，廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、生物、食品、化工等領(lǐng)域［11］。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取豹皮樟多酚工藝，旨在為豹皮樟資源的綜合開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與儀器

豹皮樟(Litsea coreana var.sinensis(Allen)Yang et H.P.Huang)葉，2013年5月采自安徽寧國(guó)，陰干后粉碎備用;沒(méi)食子酸，福林酚試劑，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Xo-1200超聲波細(xì)胞破碎儀，南京先歐儀器制造有限公司;UNICO UV-2102PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密儀器儀表有限公司;WK-400A型高速藥物粉碎機(jī);H-1650高速臺(tái)式離心機(jī)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［12］分別量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 質(zhì)量濃度為0.1 g/L 的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，各自加入1 mL福林酚試劑和2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的Na2CO3溶液，然后加入蒸餾水補(bǔ)齊至刻度，室溫避光靜置60 min，于760 nm處測(cè)定吸光度值。以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度 X，(g/L)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為:Y=6.895X+0.046 5，相關(guān)系數(shù)R=0.999 85。

1.2.2 多酚的提取及含量測(cè)定［13］稱(chēng)取5 g豹皮樟粉末，以一定的液固比加入70%乙醇溶液，在一定的功率下超聲波提取一定的時(shí)間，離心后取上清液，轉(zhuǎn)入到200 mL容量瓶中定容，即為豹皮樟多酚提取液，取適量提取液稀釋10倍作為待測(cè)溶液。量取1 mL待測(cè)溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法測(cè)定吸光度值，代入回歸方程計(jì)算得到待測(cè)溶液濃度。多酚得率(y)按式(1)計(jì)算:

式中:C—待測(cè)溶液質(zhì)量濃度，g/L;V—提取液體積，mL;N—稀釋倍數(shù);m—干葉質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 選定提取時(shí)間、液固比、超聲波功率3個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)豹皮樟多酚得率的影響，重復(fù)3次測(cè)定，取其平均值。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為了考察各因素交互作用對(duì)豹皮樟多酚得率的影響，運(yùn)用Design-Expert 7.0軟件，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原則，以提取時(shí)間、液固比、超聲波功率3個(gè)因素為自變量，多酚得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)，建立響應(yīng)值與影響因素間的數(shù)學(xué)模型，得到最佳提取條件并進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響 稱(chēng)取5 g豹皮樟粉末，設(shè)定液固比20∶1(mL∶g，下同)，超聲波功率300 W，不同提取時(shí)間對(duì)豹皮樟多酚得率的影響見(jiàn)表1。結(jié)果表明:提取時(shí)間為20 min時(shí)，多酚得率達(dá)到最大值，此后隨著時(shí)間的增加多酚得率下降，這與超聲波作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致多酚類(lèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞有關(guān)，因此，選擇提取時(shí)間為20 min左右進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.2 液固比對(duì)多酚得率的影響 設(shè)定提取時(shí)間20 min，超聲波功率300 W，改變液固比，不同液固比對(duì)豹皮樟多酚得率的影響見(jiàn)表1。結(jié)果表明:液固比為20∶1時(shí)，多酚得率達(dá)到最大值，此后隨著液固比的增大多酚得率下降，這與溶劑用量過(guò)大導(dǎo)致熱負(fù)荷增大有關(guān)，因此，選取液固比為20∶1左右進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)。

表1 不同試驗(yàn)條件對(duì)多酚得率的影響Table 1 Effects of different experimental conditions on the polyphenol yield

2.1.3 超聲波功率對(duì)多酚得率的影響 設(shè)定提取時(shí)間20 min，液固比為20∶1，改變超聲波功率，不同超聲波功率對(duì)豹皮樟多酚得率的影響見(jiàn)表1。結(jié)果表明:超聲波功率為300 W時(shí)，多酚得率達(dá)到最大值，此后隨著功率的增大多酚得率下降，這與超聲波功率過(guò)大導(dǎo)致多酚類(lèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞有關(guān)，因此，選擇超聲波功率為300 W左右進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以提取時(shí)間、液固比、超聲波功率3個(gè)因素為自變量(X)，多酚得率為響應(yīng)值(Y)，設(shè)計(jì)了3因素3水平共17組試驗(yàn)，其中1～12組為析因試驗(yàn)，13～17組為中心試驗(yàn)以分析誤差。響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，方差分析結(jié)果見(jiàn)表 3，得到的回歸模型為:Y=0.341+0.033 675X1+0.217 2X2+4.857 5 × 10-3X3+5 ×10-4X1X2+1.75 ×10-5X1X3-1.107 5 ×10-3X12-5.33 ×10-3X22-8.575 ×10-6X32。由表3可知，回歸模型的P＜0.000 1，影響極顯著，失擬項(xiàng)P=0.675 5＞0.05，影響不顯著，計(jì)算數(shù)值與實(shí)測(cè)數(shù)值擬合較好，模型能夠用于預(yù)測(cè)真實(shí)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。在一次項(xiàng)中，提取時(shí)間和液固比影響極顯著，超聲波功率影響不顯著;二次項(xiàng)中，3者影響均為極顯著;在交互項(xiàng)中，提取時(shí)間和液固比交互項(xiàng)影響顯著，其它則不顯著。各因素對(duì)多酚得率影響程度大小順序?yàn)?液固比＞提取時(shí)間＞超聲波功率。

表2 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Factors and levels of response surface design and the experimental results

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of items in regression equation

根據(jù)回歸方程，繪制響應(yīng)面圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。提取時(shí)間和液固比交互項(xiàng)響應(yīng)面坡度較陡，說(shuō)明兩者交互作用對(duì)多酚得率有較大影響。從等高線的疏密度可以看出，液固比對(duì)響應(yīng)值的影響大于提取時(shí)間和超聲波功率。上述分析與模型回歸的方差分析基本一致。

圖1 不同反應(yīng)條件對(duì)多酚得率影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface for effects of different experimental conditions on the polyphenol yield

2.2.2 最佳條件的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證試驗(yàn) 通過(guò)回歸模型的預(yù)測(cè)，得到超聲波輔助提取豹皮樟多酚的最佳工藝為:5 g樣品，提取時(shí)間22.46 min，液固比21.43∶1，超聲波功率306.09 W，在此條件下多酚得率可達(dá)3.79%。結(jié)合實(shí)際操作，將各因素調(diào)整為:提取時(shí)間22 min，液固比21∶1，超聲波功率300 W。在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，多酚平均得率為3.76%，與模型預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差＜1%，證明由該模型推測(cè)得到的最佳工藝參數(shù)真實(shí)可靠。

3 結(jié)論

3.1 采用超聲波輔助提取豹皮樟多酚，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立了多酚得率的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化出的最佳工藝條件為:5 g樣品，提取時(shí)間22 min，液固比21∶1，超聲波功率300 W，在此條件下，豹皮樟多酚得率可達(dá)3.76%，所優(yōu)化的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，穩(wěn)定可行。

3.2 超聲波提取法具有操作簡(jiǎn)便、安全無(wú)毒、成本低、提取得率高的優(yōu)點(diǎn)，容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。本試驗(yàn)為豹皮樟多酚的進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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