基于雙啟動(dòng)引物特異性檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的P C R方法

徐義剛，李丹丹，張柏棋，劉忠梅，魏冬旭，劉新亮，李蘇龍，*

（1.黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，黑龍江哈爾濱150001；2.海南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，海南海口570125；3.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧大連116001）

基于雙啟動(dòng)引物特異性檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的P C R方法

徐義剛1，李丹丹2，張柏棋3，劉忠梅1，魏冬旭1，劉新亮1，李蘇龍1，*

（1.黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，黑龍江哈爾濱150001；2.海南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，海南?？?70125；3.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧大連116001）

以單核細(xì)胞增生李斯特氏菌iap基因?yàn)榘谢颍靡恍滦蚉CR引物設(shè)計(jì)方法--雙啟動(dòng)引物（Dual-priming oligonucleotide，DPO），建立了特異性檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的DPO-PCR方法，測(cè)試了DPO-PCR方法退火溫度不敏感性、特異性及靈敏度，并在實(shí)踐檢測(cè)中進(jìn)行了初步應(yīng)用。結(jié)果顯示：該方法檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的靈敏度為1.51×102CFU/mL；退火溫度不敏感性測(cè)試中，與常規(guī)PCR引物相比，DPO引物在48～68℃退火溫度范圍內(nèi)均能夠高效率地?cái)U(kuò)增靶基因；特異性測(cè)試中，DPO-PCR方法能特異地檢測(cè)出目標(biāo)菌，與其他菌株無(wú)非特異性擴(kuò)增反應(yīng)，比常規(guī)PCR方法顯示出更強(qiáng)的特異性。實(shí)踐應(yīng)用證明，利用DPO-PCR方法對(duì)130份樣本進(jìn)行檢測(cè)，共計(jì)檢出9份單核細(xì)胞增生李斯特氏菌陽(yáng)性樣本，經(jīng)國(guó)標(biāo)法（GB/T 4789.30-2008）復(fù)檢，兩者檢測(cè)結(jié)果一致，顯示出良好的實(shí)用性，為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速準(zhǔn)確檢測(cè)提供了新方法。

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，iap基因，DPO-PCR方法

LM的常規(guī)檢測(cè)方法，操作比較繁瑣，包括細(xì)菌分離培養(yǎng)、系列生化反應(yīng)、動(dòng)力、溶血及毒力實(shí)驗(yàn)等步驟，完成鑒定工作一般需要7～10d，嚴(yán)重影響了檢測(cè)鑒定周期。全自動(dòng)免疫熒光檢測(cè)方法[5]、PCR方法[6-7]、顯色培養(yǎng)基快速檢測(cè)方法[8]和脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)[9]的應(yīng)用促進(jìn)了LM檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。特別是PCR方法，憑借其快速、靈敏、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，在LM日常檢測(cè)工作中發(fā)揮著重要作用，極大地縮短了檢測(cè)周期，提高了檢測(cè)效率。在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，又發(fā)展了Real-time PCR方法[10]和LAMP方法[11]。然而，常規(guī)引物設(shè)計(jì)不僅要反復(fù)優(yōu)化引物的各項(xiàng)參數(shù)，尤其是退火溫度，而且要反復(fù)BLAST比對(duì)引物自身的特異性，以防止非特異性擴(kuò)增，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，當(dāng)設(shè)計(jì)多重?cái)U(kuò)增引物時(shí)，更需要大量工作來(lái)優(yōu)化引物退火溫度及其特異性。

本研究引入了一種新型的PCR引物設(shè)計(jì)方法——雙啟動(dòng)寡核苷酸引物（Dual-Priming Oligonucleotide，DPO），DPO引物與常規(guī)引物相比，具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、退火溫度范圍寬、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。設(shè)計(jì)DPO引物時(shí)，不需要反復(fù)優(yōu)化引物的各項(xiàng)參數(shù)和反應(yīng)條件，特別是退火溫度，也不需要BLAST反復(fù)比對(duì)其特異性，有效地簡(jiǎn)化了PCR引物設(shè)計(jì)流程和實(shí)驗(yàn)步驟，更增強(qiáng)了檢測(cè)特異性[12-15]。本研究選擇LM高度保守的invasion associated protein（iap）基因?yàn)榘谢?，基于DPO引物建立了特異性檢測(cè)LM的DPO-PCR方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（ATCC 19111，ATCC 7644）、綿羊李斯特氏菌（ATCC 19119）、英諾克李斯特氏菌（ATCC 33090）、威爾斯李斯特氏菌（ATCC 35897）、西爾李斯特氏菌（ATCC 35967）、腸出血性大腸桿菌O157∶H7（ATCC 35150）、沙門(mén)氏菌（ATCC 10708）、志賀氏菌（ATCC 12022）、空腸彎曲菌（ATCC 33560）、霍亂弧菌（ATCC 14035）、副溶血弧菌（ATCC 27519）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）、溶藻弧菌（ATCC 33839）、創(chuàng)傷弧菌（ATCC 33149）、阪崎腸桿菌（ATCC 51329）、嗜水氣單胞菌（ATCC 7966）、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（ATCC 9610）、變形桿菌（ATCC 49027）、粘質(zhì)沙雷菌（ATCC 14756）、溶血性鏈球菌（CMCC 32121）、細(xì)菌DNA提取試劑盒 購(gòu)自TIANGEN公司；增菌培養(yǎng)基BPW 購(gòu)自北京蘭伯瑞公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2購(gòu)自TaKaRa公司；引物 由上海生工合成。

梯度PCR儀 德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)

選擇LM保守基因iap為靶基因，設(shè)計(jì)DPO引物（見(jiàn)表1）。

1.3 細(xì)菌基因組DNA的提取

試劑盒提取法，主要用于靈敏度檢測(cè)，具體操作詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。煮沸提取法，主要用于特異性和實(shí)踐檢測(cè)，方法：取1mL培養(yǎng)菌液，10000r/min離心5min，棄上清，加入150μL無(wú)菌水，混勻，沸水浴10min，10000r/min離心5min，取上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 DPO-PCR反應(yīng)體系與條件

25μL反應(yīng)體系：10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5μL，dNTP（2.5mmol/L）1.5μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.1μL，Mg2+（25mmol/L）1.5μL，上/下游DPO引物（10μmol/L）各1.0μL，DNA模板0.5μL，ddH2O 16.9μL。反應(yīng)條件：95℃5min；95℃30s，58℃ 45s，72℃ 45s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。

1.5 DPO-PCR退火溫度不敏感性實(shí)驗(yàn)

退火溫度范圍設(shè)為48～68℃，與常規(guī)PCR引物進(jìn)行比較，利用設(shè)計(jì)的DPO引物擴(kuò)增靶基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。

1.6 DPO-PCR靈敏度實(shí)驗(yàn)

將菌體濃度約為1.51×107CFU/mL的LM進(jìn)行10倍梯度稀釋，使用試劑盒提取每個(gè)稀釋度細(xì)菌DNA，以此作為模板進(jìn)行DPO-PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)以確定該方法的靈敏度。

1.7 DPO-PCR特異性實(shí)驗(yàn)

利用建立的DPO-PCR方法檢測(cè)1.1中所示菌株，以驗(yàn)證該方法的特異性。

1.8 方法的實(shí)踐驗(yàn)證

將建立的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌DPO-PCR檢測(cè)方法用于實(shí)際檢測(cè)工作中，并與國(guó)標(biāo)檢測(cè)法（GB/T 4789.30-2008食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)-單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)）進(jìn)行比較，以驗(yàn)證該方法的可行性。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPO-PCR檢測(cè)方法的建立

以單核細(xì)胞增生李斯特氏菌iap基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)DPO引物，建立了單核細(xì)胞增生李斯特氏菌DPOPCR檢測(cè)方法（圖1）。

2.2 DPO-PCR退火溫度不敏感性

結(jié)果顯示，在48～68℃退火溫度范圍內(nèi)，利用DPO引物均能夠高效擴(kuò)增出靶基因且無(wú)非特異性條帶產(chǎn)生（圖2-B），說(shuō)明DPO引物退火溫度范圍較寬，而常規(guī)PCR引物則存在最適退火溫度（圖2-A）。

表1 引物序列Table 1 Primers used in this work

圖1 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌DPO-PCR檢測(cè)方法的建立Fig.1 Development of DPO-PCR method for LM注：M：DNA marker 2000；1，2：DPO-PCR陽(yáng)性結(jié)果；3：陰性對(duì)照。

圖2 DPO-PCR方法退火溫度不敏感性Fig.2 Annealing temperature insensitivity of DPO-PCR method注：A：常規(guī)PCR結(jié)果；B：DPO-PCR結(jié)果；M：DNA marker 100 ladder；1～8：48.3、51.4、53.7、56.4、59.1、61.7、66.1、68.0℃。

2.3 DPO-PCR方法的靈敏度

結(jié)果顯示，所建立的DPO-PCR方法能夠有效檢測(cè)出濃度為1.51×102CFU/mL的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，說(shuō)明該方法的檢測(cè)靈敏度為151CFU/mL。

圖3 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌DPO-PCR檢測(cè)方法靈敏度Fig.3 Detection sensitivity of DPO-PCR method for LM注：M：DNA marker 2000；1：1.51×107CFU/mL；2：1.51×106CFU/mL；3：1.51×105CFU/mL；4：1.51×104CFU/mL；5：1.51×103CFU/mL；6：1.51×102CFU/mL；7：1.51×101CFU/mL。

2.4 DPO-PCR方法的特異性

結(jié)果顯示，利用建立的DPO-PCR方法檢測(cè)1.1所示菌株，僅單核細(xì)胞增生李斯特氏菌為陽(yáng)性結(jié)果，其他菌株為陰性結(jié)果，且無(wú)非特異性反應(yīng)（圖4-B，C），而常規(guī)PCR方法存在非特異性反應(yīng)（圖4-A），說(shuō)明DPO-PCR方法的特異性較強(qiáng)。

圖4 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌DPO-PCR檢測(cè)方法特異性Fig.4 Specificity of DPO-PCR method for LM注：A：常規(guī)PCR方法特異性結(jié)果；B：DPO-PCR方法特異性結(jié)果；M：DNA marker 2000；1～17為：?jiǎn)魏思?xì)胞增生李斯特氏菌（ATCC 19111），單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（ATCC 7644），腸出血性大腸桿菌O157∶H7（ATCC 35150），嗜水氣單胞菌（ATCC 7966），空腸彎曲菌（ATCC 33560），阪崎腸桿菌（ATCC 51329），沙門(mén)氏菌（ATCC 10708），霍亂弧菌（ATCC 14035），副溶血弧菌（ATCC 27519），溶藻弧菌（ATCC 33839），創(chuàng)傷弧菌（ATCC 33149），志賀氏菌（ATCC12022），金黃色葡萄球菌（ATCC29213），粘質(zhì)沙雷菌（ATCC 14756），變形桿菌（ATCC 49027），溶血性鏈球菌（CMCC 32121），小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（ATCC 9610）；C：DPO-PCR特異性結(jié)果；M：DNA marker 2000；1～6為：陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照，英諾克李斯特氏菌（ATCC 33090），綿羊李斯特氏菌（ATCC 19119），西爾李斯特氏菌（ATCC 35967），威爾斯李斯特氏菌（ATCC 35897）。

2.5 方法的實(shí)踐驗(yàn)證

利用建立的DPO-PCR檢測(cè)方法對(duì)130份涉及進(jìn)出口食品樣品、市場(chǎng)流通食品樣品和人工樣本進(jìn)行了檢測(cè)，共檢出9份單核細(xì)胞增生李斯特氏菌陽(yáng)性樣本，經(jīng)國(guó)標(biāo)法（GB/T 4789.30-2008）驗(yàn)證符合率為100%（見(jiàn)表2），而常規(guī)PCR法出現(xiàn)了3份假陽(yáng)性結(jié)果，顯示出所建立的DPO-PCR方法具有良好的可靠性和實(shí)用性。

3 結(jié)論與討論

以PCR技術(shù)為代表的核酸檢測(cè)方法，引物設(shè)計(jì)是保證結(jié)果準(zhǔn)確、可靠的前提條件。在設(shè)計(jì)常規(guī)PCR引物時(shí)，需要反復(fù)優(yōu)化引物的各項(xiàng)參數(shù)以及在實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化PCR反應(yīng)的退火溫度，以實(shí)現(xiàn)靶基因的高效率擴(kuò)增。此外，為確保擴(kuò)增反應(yīng)的特異性，對(duì)引物序列還需要反復(fù)BLAST分析，操作較繁瑣，特別是在設(shè)計(jì)多重PCR檢測(cè)方法時(shí)，為獲得較理想的PCR引物組和反應(yīng)條件，需要的工作量則更大。

表2 DPO-PCR檢測(cè)方法的實(shí)踐應(yīng)用Table 2 Application of the DPO-PCR method in practice

本研究引入了一種新型的PCR引物設(shè)計(jì)方法，即雙啟動(dòng)寡核苷酸引物（Dual-Priming Oligonucleotide，DPO），建立了單核細(xì)胞增生李斯特氏菌DPO-PCR檢測(cè)方法。與常規(guī)PCR引物相比，DPO引物設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)中只需先確定DPO引物的短3’-端，長(zhǎng)度在6～15bp，保證其GC含量在40%～80%范圍內(nèi)，然后反相延伸18～25bp，使其Tm值大于65℃，形成DPO引物的長(zhǎng)5’-端，中間用多聚次黃嘌呤（poly I）連接，即完成DPO引物設(shè)計(jì)，不需要優(yōu)化引物的各項(xiàng)參數(shù)，簡(jiǎn)化了PCR引物設(shè)計(jì)步驟。與常規(guī)PCR引物存在最適退火溫度相比，DPO引物的特殊結(jié)構(gòu)賦予了其較寬的退火溫度范圍，實(shí)驗(yàn)中，DPO引物在48～68℃退火溫度內(nèi)均可獲得靶基因序列的高效率擴(kuò)增且無(wú)非特異性擴(kuò)增反應(yīng)，所以不需要對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，省時(shí)省力。DPO引物也為建立多重PCR方法提供了更佳便捷的途徑。

此外，DPO引物的特異性比常規(guī)PCR引物更強(qiáng)。由于DPO引物中poly I的氫鍵結(jié)合力弱，擴(kuò)增時(shí)，如果DPO引物5’-端或3’-端有3個(gè)以上堿基錯(cuò)配，引物就會(huì)與模板脫離，而終止反應(yīng)，有效地阻斷了非特異性擴(kuò)增，而引物自身以及引物間難形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，更提高了擴(kuò)增效率[15]。特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利用DPOPCR方法能夠準(zhǔn)確地鑒別出目標(biāo)菌，與其他菌株無(wú)交叉反應(yīng)及非特異性擴(kuò)增，常規(guī)PCR方法的特異性表現(xiàn)相對(duì)較差。實(shí)踐應(yīng)用證明，建立的DPO-PCR方法的檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確，顯示了良好的可靠性和實(shí)用性，為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)提供了更加可靠的手段。

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Dual-priming primers-based PCR method for specific detection of Listeria monocytogenes

XU Yi-gang1，LI Dan-dan2，ZHANG Bai-qi3，LIU Zhong-mei1，WEI Dong-xu1，LIU Xin-liang1，LI Su-long1，*
（1.Technical Centre of Heilongjiang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Harbin 150001，China；2.Technical Centre of Hainan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Haikou 570125，China；3.Liaoning Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Dalian 116001，China）

In this study，a Dual-priming oligonucleotide（DPO）-based PCR method for specific detection of L.monocytogenes was developed with iap gene as target.Annealing temperature insensitivity，specificity and detection sensitivity of the DPO-PCR method were tested and its preliminary application was carried out in practice.Results showed that the detection sensitivity of the DPO-PCR method was 151CFU/mL.In the annealing temperature insensitivity test，compared with conventional PCR primers，DPO primers were able to efficiently amplify target gene in the annealing temperature range of 48～68℃.In the specificity test，the DPOPCR method showed a higher specificity for the target bacteria than conventional PCR method and no nonspecific amplification reactions were observed in DPO-PCR.In practice，9 L.monocytogenes positive samples from 130 samples were detected by the DPO-PCR method，which was in accordance with the testing results according to GB/T 4789.30-2008，showing a better practicability.The DPO-PCR provided a new method for fast and accurate detection of L.monocytogenes.

Listeria monocytogenes；iap gene；DPO-PCR method

TS207.4

A

1002-0306（2014）10-0086-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.10.010

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種人畜共患病病原菌，可引起敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多等臨床癥狀[1-2]。LM在自然界中廣泛存在，常見(jiàn)于地表水、污水、土壤、青儲(chǔ)飼料和腐敗蔬菜中。LM也是一種食源性致病菌，主要通過(guò)食入被污染的雞肉、鮮奶、冰激凌、色拉、凍豬舌、生牛排、蔬菜而感染[3-4]。該菌在4℃環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。因此，快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)方法是預(yù)防LM感染和保障食品安全的重要手段。

2013-09-26 *通訊聯(lián)系人

徐義剛（1978-），男，博士，高級(jí)獸醫(yī)師，研究方向：微生物檢測(cè)技術(shù)。

國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012IK157）；質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201310126）。