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    葛根素對(duì)血管性癡呆小鼠皮層神經(jīng)元延遲整流鉀電流的作用

    2014-11-05 01:02:14田華劉富劉冰華高音曲麗輝
    科技創(chuàng)新導(dǎo)報(bào) 2014年11期
    關(guān)鍵詞:葛根素

    田華++劉富++劉冰華++高音++曲麗輝

    摘 要:目的:旨在觀察葛根素對(duì)血管性癡呆小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制的探討。方法:通過(guò)采用改良的雙側(cè)頸總動(dòng)脈持久性結(jié)扎法制作血管性癡呆模型,并利用全細(xì)胞式膜片鉗技術(shù)及分子生物學(xué)技術(shù),觀察葛根素對(duì)血管性癡呆小鼠皮層神經(jīng)元延遲整流鉀電流的影響。結(jié)果:(1)與正常組相比,血管性癡呆小鼠皮層神經(jīng)元Ik電流強(qiáng)度下降,下降幅度為14.79%±5.6%(P<0.05)。(2)與模型組相比,葛根素組的Ik電流幅度呈現(xiàn)顯著下降抑制率為(34.48±8.3)%(n=5,P﹤0.01)。(3)Western blot結(jié)果顯示,模型組KV 2.1表達(dá)低于正常組(P<0.05);與正常組和模型組相比,葛根素組KV 2.1的表達(dá)量均明顯降低(P<0.05)。結(jié)論:葛根素可能通過(guò)抑制延遲整流鉀電流對(duì)血管性癡呆小鼠皮層神經(jīng)元發(fā)揮一定的神經(jīng)保護(hù)作用。

    關(guān)鍵詞:葛根素 頂葉皮層 全細(xì)胞式膜片鉗技術(shù) 延遲整流鉀電流

    中圖分類號(hào):G64 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1674-098X(2014)04(b)-0250-02

    血管性癡呆(vascular dementia,VD)是繼阿爾茨海默病之后第二位最常見(jiàn)的癡呆癥,在我國(guó)老年人中尤為常見(jiàn)和多發(fā)。血管性癡呆實(shí)際上是指大腦功能衰退,特別是與智能有關(guān)的功能全面衰退。造成腦血管性癡呆的主要原因是腦血流量減少, 引起腦組織生化代謝障礙[1-2]。

    葛根素(Puerarin,Pur)從葛根中提取出的有效成分,化學(xué)名為4,7—一二羥基-8-D葡萄糖基異黃酮,近年對(duì)葛根的研究較為深入,目前葛根素被廣泛用于心腦血管疾病等急性期的治療,包括心絞痛、心肌梗塞,心律失常、腦缺血等[3]。臨床研究發(fā)現(xiàn),葛根素能明顯降低腦梗死患者的梗死灶面積,降低急性腦梗死患者的血流變和提高神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分[4]。各種離子通道的結(jié)構(gòu)和功能異常與心腦血管疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),文獻(xiàn)報(bào)道,葛根素可不同程度的影響心肌鈉、鉀、鈣離子通道[5-6]。然而對(duì)于葛根素的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制的研究方法主要集中在利用酶學(xué)、形態(tài)學(xué)及免疫組化等方面,利用膜片鉗技術(shù)考察葛根素其神經(jīng)保護(hù)作用的研究較少,唐瑜等利用膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn),葛根素可以抑制腦缺血再灌注損傷的大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞L-型鈣通道[7],但是葛根素對(duì)小鼠皮層神經(jīng)元鉀離子通道的作用如何目前仍未見(jiàn)報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)擬采用全細(xì)胞式膜片鉗技術(shù)觀察葛根素對(duì)血管性癡呆小鼠頂葉皮層神經(jīng)元延遲整流鉀電流(IK)的調(diào)制作用,從離子通道角度為進(jìn)一步揭示葛根素防治缺血性腦損傷的可能機(jī)制奠定一定的理論基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    (1)建立動(dòng)物模型及分組成年昆明小鼠,18~22 g,雌雄不限,由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物研究中心提供。采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈持久性結(jié)扎法,并對(duì)該方法進(jìn)行改良制作血管性癡呆模型,采用跳臺(tái)試驗(yàn)鑒別血管性癡呆動(dòng)物模型是否成功建立。模型建立后小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和葛根素組,各組立即給予相應(yīng)藥物。正常組和模型組:腹腔注射生理鹽水,1次/日,注射14天。葛根素組:腹腔注射葛根素注射液(1 mg/mL),1.0 mL/100 g,1次/日,注射14 d。

    (2)試劑與儀器 Protease、EGTA 、HEPES均為Sigma公司產(chǎn)品,葛根素注射液(安徽聯(lián)誼藥業(yè)股份有限公司);β-actin、Kv2.1抗體及其相應(yīng)二抗購(gòu)自santa cluz公司,其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。IBBMClamp32數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)以及PC-IIC型膜片鉗放大器均由華中理工大學(xué)研制。

    (3)神經(jīng)元急性分離與全細(xì)胞記錄。將小鼠急性斷頭取腦,取頂葉皮質(zhì),并置于人工腦脊液(ASF)(0~4 ℃)中,將其切成冠狀腦片(厚度約400~500 μm),在預(yù)先通好(95% O2+5% CO2)混合氣的ASF(37℃)中孵育30min,之后在含0.5%protease的ASF(37℃)中消化30-35 min,連續(xù)通混合氣并微震蕩腦片。消化結(jié)束后,取2片腦片用0~4℃ASF沖洗3次,用剪刀將組織剪碎成1mm3的組織塊,用尖端拋光的Pasteur吸管吹打并吹散組織塊,靜置3~5 min后,吸取上清液滴于預(yù)先備好的細(xì)胞外液培養(yǎng)皿中,靜置待細(xì)胞貼壁,選取狀態(tài)良好的神經(jīng)元進(jìn)行全細(xì)胞式膜片鉗實(shí)驗(yàn),首先使電極貼近細(xì)胞并形成高阻封接(>1 G?),負(fù)壓吸引形成全細(xì)胞式,在電壓鉗模式下,將保持電壓(HP)置于-80 MV,首先給予﹣40MV的預(yù)刺激,波寬150 ms,隨后給予去極化脈沖刺激(﹣40 MV—+60 MV),階躍電壓10MV,刺激波寬150 ms,以300 ms處的電流值計(jì)算IK并觀察其變化。

    (4)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中IK以300 ms處的電流值統(tǒng)計(jì)計(jì)算,抑制率計(jì)算公式為:(1-IK實(shí)驗(yàn)組/IK對(duì)照組)×100%。結(jié)果分析采用SPSS軟件,結(jié)果用(x±SD)表示,t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

    2 結(jié)果

    2.1 葛根素注射液對(duì)血管性癡呆小鼠皮層神經(jīng)元Ik的抑制作用

    急性分離各組小鼠皮層神經(jīng)元,取狀態(tài)良好的神經(jīng)元進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。形成全細(xì)胞封接后,以300 ms處的電流值計(jì)算IK。記錄的外向電流可被四氨基吡啶(4-AP)(2 μmol/L)和四乙胺(TEA)(10 μmol/L)所抑制,用CSCl替換電極內(nèi)液KCl則不能激活出此外向電流,證實(shí)該電流為延遲整流鉀電流并記錄。以在指令電壓+60 mV時(shí)電流值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,與正常組相比,血管性癡呆小鼠皮層神經(jīng)元Ik電流幅度有所下降,下降幅度為(14.79±5.6)%(P<0.05);與模型組相比,葛根素組的Ik電流幅度呈現(xiàn)顯著下降,抑制率為(34.48±8.3)%(n=5,P﹤0.01)。

    2.2 葛根素對(duì)血管性癡呆小鼠皮層Kv2.1蛋白表達(dá)量的影響

    急性分離的各組小鼠頂葉皮層腦組織,用細(xì)胞裂解液處理,細(xì)胞蛋白溶出,進(jìn)行蛋白定量,采用Western blot方法,用抗體檢測(cè)細(xì)胞KV 2.1含量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,正常組、模型組、葛根素組均可見(jiàn)有KV 2.1表達(dá)條帶;定量分析顯示,模型組KV 2.1表達(dá)低于正常組(P<0.05);與正常組和模型組比較,而葛根素組KV 2.1的表達(dá)量均明顯降低(P<0.01,P<0.05)。endprint

    3 討論

    腦血管性癡呆與離子通道結(jié)構(gòu)和功能異常之間有著密切的關(guān)系,鉀通道是分布最廣、類型最多的一類離子通道,具有種類多、亞型多、性質(zhì)復(fù)雜等的特點(diǎn),幾乎存在于所有的細(xì)胞膜上并發(fā)揮著多種生物功能。本實(shí)驗(yàn)中,在電壓為-40 mV時(shí)瞬時(shí)外向鉀電流已經(jīng)失活,激活的外向電流可以被4-AP和TEA所抑制,此外,若電極內(nèi)液KCl被CsCl替代后則不能激活出此外向電流,因此可證實(shí)此外向電流是電壓門(mén)控性延遲整流鉀電流。

    以往研究主要通過(guò)考察葛根素對(duì)大、小鼠各腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)、酶類或者神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響試圖揭示葛根素對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用及機(jī)制,如葛根素對(duì)缺氧缺糖、谷氨酸鈉引起的體外培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[8],能減少突觸體鈣超載和神經(jīng)元陽(yáng)性凋亡細(xì)胞出現(xiàn)率, 提示葛根素的抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用與抑制突觸體鈣超載有關(guān)[9]。但從離子通道角度探討葛根素的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制,尤其是葛根素對(duì)血管性癡呆動(dòng)物模型離子通道的影響報(bào)道較少。

    研究表明,腦缺血所致的腦組織損傷可使神經(jīng)元細(xì)胞膜鉀通道失活,細(xì)胞膜去極化,導(dǎo)致細(xì)胞興奮性升高, 致使膜電位不易恢復(fù)。IK電流是由延遲整流鉀通道介導(dǎo)的鉀離子外流產(chǎn)生的,能延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程,影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,還可參與皮層神經(jīng)元的調(diào)亡過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),血管性癡呆小鼠腹腔注射葛根素注射液14天后,絕大多數(shù)小鼠的頂葉皮層神經(jīng)元的IK明顯降低,同時(shí)分子生物學(xué)結(jié)果顯示,葛根素可降低血管性癡呆小鼠頂葉皮層腦區(qū)Kv2.1蛋白的表達(dá)。以上結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示葛根素血管性癡呆小鼠頂葉皮層神經(jīng)元IK有抑制作用,可能會(huì)影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,參與機(jī)體免疫與炎癥反應(yīng)過(guò)程,調(diào)節(jié)機(jī)體在生理或病理?xiàng)l件下的免疫功能。研究發(fā)現(xiàn),在神經(jīng)元退行性變過(guò)程中,鉀通道阻斷劑TEA通過(guò)阻斷IK電流發(fā)揮保護(hù)易感細(xì)胞亞群的作用。那么,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)葛根素對(duì)血管性癡呆小鼠皮層延遲整流鉀電流也存在一定的抑制作用,提示,葛根素可能在神經(jīng)元退行性變過(guò)程中也可能發(fā)揮一定的保護(hù)易感細(xì)胞亞群的作用,但具體機(jī)制如何尚不明確,有待進(jìn)一步研究。

    參考文獻(xiàn)

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