京尼平預(yù)處理對脫礦牙本質(zhì)膠原機(jī)械性能的影響

沙鑫家，王玉睿，周三玲，李 娜，劉瑞瑞

(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室:1.特診科;2.兒童口腔科;3.修復(fù)科，陜西 西安 710032)

牙本質(zhì)粘結(jié)主要通過粘結(jié)樹脂向脫礦牙本質(zhì)表層的膠原纖維網(wǎng)滲透形成混合層和樹脂突所提供的微機(jī)械嵌合力而獲得粘結(jié)力，而以往實(shí)驗(yàn)證實(shí)，樹脂－牙本質(zhì)粘結(jié)界面混合層底部裸露膠原的降解可破壞粘結(jié)界面的封閉和穩(wěn)定，是引起牙本質(zhì)粘結(jié)界面老化，并進(jìn)而導(dǎo)致粘結(jié)修復(fù)失敗的主要原因之一［1］。Ⅰ型膠原作為牙本質(zhì)有機(jī)基質(zhì)的主要成分，憑借其天然交聯(lián)狀態(tài)所具有的黏彈性和穩(wěn)定性而維持著牙本質(zhì)有機(jī)結(jié)構(gòu)。近年來，受組織工程醫(yī)學(xué)中應(yīng)用交聯(lián)劑有效改性膠原支架材料的機(jī)械性能的啟發(fā)，有學(xué)者嘗試用富含天然交聯(lián)劑京尼平的梔子提取物預(yù)處理脫礦牙本質(zhì)，初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，京尼平預(yù)處理可增強(qiáng)脫礦牙本質(zhì)的機(jī)械強(qiáng)度，有助于樹脂牙本質(zhì)即刻微拉伸粘結(jié)強(qiáng)度的提高［2］。但在以往的研究中，用于配制京尼平預(yù)處理劑的溶劑與現(xiàn)有粘結(jié)系統(tǒng)的溶劑類型不一致，預(yù)處理方法和時(shí)間不宜于臨床應(yīng)用［3］。故本實(shí)驗(yàn)配制與現(xiàn)有粘結(jié)系統(tǒng)溶劑一致的京尼平預(yù)處理劑用于牙本質(zhì)酸蝕后、粘結(jié)前的預(yù)處理，觀察不同溶劑配制的京尼平預(yù)處理劑對脫礦牙本質(zhì)膠原交聯(lián)度及極限拉伸強(qiáng)度的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

富含京尼平(純度＞95%)的梔子提取物(西安天本生工);蒸餾水、生理鹽水、乙醇、丙酮、液氮、茚三酮(北京鼎國);常溫離心機(jī)(SIGMA，美國);冷凍干燥機(jī)、電子天平(HITACHI，日本);低速切割機(jī)(NSK，日本);酶標(biāo)儀(Bio－RAD，美國);萬能測試機(jī)(Shimadzu，日本)。實(shí)驗(yàn)所用牙齒為30 d內(nèi)拔除的無齲第三磨牙，貯存于4℃的5 g/L疊氮鈉溶液中。

1.2 方法

1.2.1 京尼平預(yù)處理劑的配置

精確稱取富含京尼平的梔子提取物粉，分別以蒸餾水、乙醇液、丙酮液作為溶劑，各配制成含京尼平重量體積百分濃度為5%、10%、15%的預(yù)處理劑;然后用NaOH滴定至pH=7.2備用。

1.2.2 京尼平預(yù)處理對膠原交聯(lián)度影響的觀察

1.2.2.1 脫礦牙本質(zhì)試樣的制備

取新鮮拔除的無齲第三磨牙10個(gè)，流水降溫條件下用低速切割機(jī)截取其冠部牙本質(zhì)，并制成厚度為1.0 mm的牙本質(zhì)片。將所有牙本質(zhì)片置于液氮中冷凍30 min后，用研缽磨成牙粉;然后篩選直徑＜20 μm的牙粉置于100 g/L磷酸液中4℃下脫礦5 h;蒸餾水反復(fù)離心洗滌5次(4000 r/min，10 min)后，濾紙吸干，冷凍干燥備用。

1.2.2.2 實(shí)驗(yàn)分組和京尼平預(yù)處理

取上述脫礦后的牙本質(zhì)粉分裝于離心管中(每管1 mg)，并根據(jù)不同溶劑(蒸餾水、乙醇、丙酮)配置的京尼平預(yù)處理劑將其隨機(jī)分為3個(gè)大組;每一個(gè)大組再根據(jù)京尼平濃度(5%、10%、15%)各隨機(jī)分為3個(gè)亞組(共9組，每組3管)。然后按分組分別于每管中各加入5 mL相應(yīng)的京尼平預(yù)處理劑，室溫下處理60 s;蒸餾水反復(fù)離心洗滌后，冷凍干燥備檢。

1.2.2.3 膠原交聯(lián)度的測定

分別取預(yù)處理前(用于對照)和預(yù)處理后(各實(shí)驗(yàn)組)的牙本質(zhì)粉試樣置于20 mL試管中，每管加入300 μL蒸餾水并靜置1 h后，再分別于每管中各加入 3 mL茚三酮試劑，100℃水浴加熱20 min;待其冷卻至室溫時(shí)，每管各加入15 mL 600 mL/L的乙醇液并混勻。然后從每個(gè)試管中各吸取200 μL混合液，并以蒸餾水作為空白對照，分別在酶標(biāo)儀上測其570 nm波長下的吸光度值;隔天重復(fù)測1次，所有操作均在暗室中進(jìn)行。同時(shí)以甘氨酸系列標(biāo)準(zhǔn)液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將各樣本的吸光度值代入曲線計(jì)算其自由α氨基酸的量;并按以下公式計(jì)算其膠原的交聯(lián)度。交聯(lián)度(%)=(M0－Mt)/M0×100%。式中M0和Mt分別為京尼平處理前后牙本質(zhì)粉中自由α氨基酸的量。

1.2.3 京尼平預(yù)處理對脫礦牙本質(zhì)拉伸強(qiáng)度影響的觀察

1.2.3.1 牙本質(zhì)片試件的制備

取新鮮拔除的無齲第三磨牙30個(gè)，在流水降溫下用低速切割機(jī)沿牙體長軸切取牙本質(zhì)片，并將其修整成 0.5 mm(厚)×2.0 mm(寬)×8.0 mm(長)的長形試件(每個(gè)牙可制備6～8條)。然后用金剛砂車針在每個(gè)牙本質(zhì)試件中心部位修整成“漏斗形”，中央頸部寬約0.5 mm，最終用精度為0.02 mm的游標(biāo)卡尺測量并確定試件尺寸。

1.2.3.2 實(shí)驗(yàn)分組和京尼平預(yù)處理

取上述所有牙本質(zhì)片試件，分別用100 g/L磷酸液4℃下脫礦5 h;蒸餾水反復(fù)離心洗滌5次(4000r/min，10 min)，濾紙吸干后用X射線檢查各樣本的脫礦情況。取脫礦完成的牙本質(zhì)片試件180個(gè)，根據(jù)不同試劑、不同京尼平濃度將其隨機(jī)分為9個(gè)實(shí)驗(yàn)組和3個(gè)溶劑(蒸餾水、乙醇、丙酮)對照組，每組15個(gè)試件。然后將9個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別置于5 mL不同溶劑配制的不同濃度京尼平預(yù)處理劑中浸泡60 s;3個(gè)對照組分別置于3種溶劑中浸泡60 s，蒸餾水反復(fù)清洗后用于以下測試。

1.2.3.3 極限拉伸強(qiáng)度測試

取上述處理后的各組牙本質(zhì)片試件，分別固定于測試底座上，用精度為0.02 N的萬能測試機(jī)以0.5 mm/min的速度進(jìn)行加載，直至牙本質(zhì)斷裂;分別記錄各試件斷裂時(shí)的最大載荷數(shù)值(N)，并計(jì)算其拉伸強(qiáng)度:極限拉伸強(qiáng)度=載荷數(shù)值/試件橫截面積(MPa)。測試過程中保持試件濕潤。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 京尼平預(yù)處理對膠原交聯(lián)度的影響

蒸餾水、乙醇、丙酮3種溶劑配制的京尼平預(yù)處理劑對脫礦牙本質(zhì)粉進(jìn)行處理后，其膠原的交聯(lián)度均隨京尼平濃度的增加而增加，各濃度組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);相同京尼平濃度組內(nèi)不同溶劑相比，無論京尼平濃度是5%，還是10%或15%，其膠原的交聯(lián)度均以乙醇溶劑組最高，蒸餾水溶劑組最低，各溶劑組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)(表1)。

表1 不同預(yù)處理組膠原交聯(lián)度比較(%，)

表1 不同預(yù)處理組膠原交聯(lián)度比較(%，)

A、B、C為同溶劑組內(nèi)不同濃度相比，d、e、f為同濃度組內(nèi)不同溶劑相比;不同字母為P＜0.05

0.05 0.1 0.15蒸餾水 30.50 ±0.77Ad 41.09 ±1.20Bd 45.71 ±1.78溶劑 京尼平濃度(mg/mL)Cd乙醇 42.87 ±1.02Ae 45.62 ±0.93Be 55.98 ±2.05Ce丙酮 34.58 ±0.86Af 42.77 ±1.11Bf 49.51 ±1.60Cf

2.2 京尼平預(yù)處理對脫礦牙本質(zhì)拉伸強(qiáng)度的影響

脫礦牙本質(zhì)片試件分別經(jīng)3種溶劑(蒸餾水、乙醇、丙酮)配制的京尼平預(yù)處理劑處理后，其極限拉伸強(qiáng)度均隨著京尼平濃度的增加而增強(qiáng)，各濃度組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);相同京尼平濃度情況下，不同溶劑組的極限拉伸強(qiáng)度相比，各濃度組內(nèi)各溶劑間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)(表2)。

表2 不同預(yù)處理組試件的極限拉伸強(qiáng)度比較(MPa，)

表2 不同預(yù)處理組試件的極限拉伸強(qiáng)度比較(MPa，)

A～D為同溶劑組內(nèi)不同濃度相比，a為同濃度組內(nèi)不同溶劑相比;不同字母為P ＜0.05

0.05 0.1 0.15蒸餾水 12.70 ±2.17Aa 13.97 ±3.42Ba 20.56 ±3.15Ca 24.54 ±5.08溶劑 京尼平濃度(mg/mL)對照組Da Da乙醇 13.43 ± 3.71Aa 15.78 ±4.02Ba 21.04 ± 5.17Ca 24.69 ±3.29Da丙酮 14.47 ± 4.08Aa 15.31 ±3.78Ba 21.89 ± 3.65Ca 24.93 ±4.83

3 討論

在以往的組織工程研究中，為了提高膠原支架的機(jī)械性能，常采用外源性交聯(lián)劑對膠原進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)改性，從而使膠原分子內(nèi)部和分子之間通過共價(jià)鍵結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)提高纖維張力和維持一定的拉伸強(qiáng)度［4］。在口腔粘結(jié)學(xué)領(lǐng)域，脫礦后裸露的牙本質(zhì)膠原纖維網(wǎng)為交聯(lián)劑的應(yīng)用提供了作用靶點(diǎn)，如何改善粘結(jié)界面膠原網(wǎng)架的機(jī)械性能也就成為了直接影響牙本質(zhì)粘結(jié)效果的關(guān)鍵。因此，國內(nèi)外學(xué)者一直在探尋交聯(lián)改性改進(jìn)牙本質(zhì)粘結(jié)界面的方法和材料。戊二醛是目前常用的一類交聯(lián)劑，可在較短時(shí)間內(nèi)完成對I型膠原的交聯(lián);但其具有一定的細(xì)胞毒性，并且能發(fā)生自聚而降低交聯(lián)效率。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，用京尼平交聯(lián)體系處理牙本質(zhì)粘結(jié)界面20 min后，可增強(qiáng)膠原纖維的交聯(lián)程度，并使即刻粘結(jié)強(qiáng)度提高，表明京尼平是一種很有潛力的膠原交聯(lián)體系。本結(jié)果顯示，京尼平預(yù)處理劑不僅能呈濃度依賴性地增強(qiáng)膠原的交聯(lián)度，還能顯著提升膠原的極限拉伸強(qiáng)度，提示京尼平是一類效能較佳的牙本質(zhì)粘結(jié)用膠原交聯(lián)劑。

京尼平是一種純天然植物的提取物，屬于環(huán)烯醚萜類雜環(huán)化合物，關(guān)于其交聯(lián)機(jī)理目前尚不甚清楚。有研究認(rèn)為，明膠中只有伯胺能夠與京尼平直接發(fā)生反應(yīng)，伯胺通過親核進(jìn)攻京尼平的第三個(gè)碳原子，使京尼平開環(huán)形成醛基;隨后仲胺基團(tuán)通過攻擊這個(gè)醛基而形成一個(gè)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的聚合物［5］。目前認(rèn)為，京尼平與殼聚糖的交聯(lián)過程是:殼聚糖分子的第二個(gè)碳原子上的氨基通過親核進(jìn)攻京尼平的第三個(gè)碳原子，導(dǎo)致二氫吡喃環(huán)打開并形成含氮的環(huán)烯醚萜，然后再脫水形成雜環(huán)中間體，中間體經(jīng)聚合形成高度共軛的雜環(huán)京尼平衍生物;此外經(jīng)SN2親核取代反應(yīng)顯示，京尼平的酯鍵與殼聚糖的氨基發(fā)生取代反應(yīng)后生成仲酰胺鍵，并形成一個(gè)聚合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)［5］。以上結(jié)果表明，京尼平能夠與含有氨基的化合物形成分子內(nèi)和分子間的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。而且京尼平與戊二醛在交聯(lián)過程中形成的結(jié)構(gòu)完全不同，戊二醛為網(wǎng)狀的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，而京尼平為環(huán)狀的交聯(lián)結(jié)構(gòu)。提示，京尼平能夠形成穩(wěn)定、有效的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其抗降解能力較戊二醛好。

京尼平作為一種天然提取物，其生物學(xué)活性易受提取工藝、溶劑成分、pH值、工作濃度等因素的影響［6－7］，因此本實(shí)驗(yàn)選用與臨床常用粘結(jié)劑一致的溶劑(乙醇和丙酮)配制京尼平預(yù)處理劑，以了解不同類型溶劑對京尼平交聯(lián)性能的影響。結(jié)果顯示，京尼平濃度和處理時(shí)間相同條件下，乙醇溶劑組和丙酮溶劑組的膠原交聯(lián)度均明顯高于水溶劑組。其原因可能是:乙醇和丙酮與溶質(zhì)形成氫鍵的能力比蒸餾水低，當(dāng)京尼平與該溶劑發(fā)生溶解作用時(shí)有更多的氫鍵形成位點(diǎn)空余，有助于其與脫礦牙本質(zhì)膠原纖維作用時(shí)形成氫鍵，從而產(chǎn)生較強(qiáng)的交聯(lián)作用［8－9］。提示，乙醇是一類較為合適的京尼平預(yù)處理溶劑。

綜上所述，采用與現(xiàn)有粘結(jié)系統(tǒng)溶劑相同的京尼平預(yù)處理劑對脫礦牙本質(zhì)進(jìn)行處理，能顯著促進(jìn)牙本質(zhì)膠原的交聯(lián)，并進(jìn)而提高其極限拉伸強(qiáng)度，且其效能呈濃度依賴性。但臨床上應(yīng)用京尼平進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，其應(yīng)用方式尚需進(jìn)一步深入探討。

［1］Jelly R，Patton EL，Lennard C，et al.The detection of latent fingermarks on porous surfaces using amino acid sensitive rea-gents:a review［J］.Anal Chim Acta，2009，652(1－2):128－142.

［2］Vaidyanathan TK，Vaidyanathan J.Recent advances in the theory and mechanism of adhesive resin bonding to dentin:A critical review［J］.J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2009，88(2):558－578.

［3］Sung HW，Chang WH，Ma CY，et al.Crosslinking of biological tissues using genipin and/or carbodiimide［J］.J Biomed Mater Res A，2003，64(3):427－438.

［4］Hiraishi N，Sono R，Sofiqul I，et al.In vitro evaluation of plant－ derived agents to preserve dentin collagen［J］.Dent Mater，2013，29(10):1048 －1054.

［5］Bedran－Russo AK，Pereira PN，Duarte WR，et al.Application of crosslinkers to dentin collagen enhances the ultimate tensile strength［J］.J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2007，80(1):268－272.

［6］Al－Ammar A，Drummond JL，Bedran－Russo AK.The use of collagen cross－linking agents to enhance dentin bond strength［J］.J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2009，91(1):419－424.

［7］Hiraishi N，Sono R，Sofiqul I，et al.In vitro evaluation of plant－ derived agents to preserve dentin collagen［J］.Dent Mater，2013，29(10):1048 －1054.

［8］Walter R，Miguez PA，Arnold RR，et al.Effects of natural cross－linkers on the stability of dentin collagen and the inhibition of root caries in vitro［J］.Caries Res，2008，42(4):263 －268.

［9］金勛杰，閆景龍，周磊，等.京尼平交聯(lián)明膠特性隨時(shí)間變化的研究［J］.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2008，25(1):150－153.